小麥TaCIPK16基因的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、近年來發(fā)現(xiàn)CBL蛋白（Calcineurin B-like protein）是植物所特有的一類Ca2+感受器，CIPK蛋白（CBL-interacting Protein Kinase）是與其相互作用的蛋白激酶，兩者共同組成 Ca2+-CBL-CIPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。CBL-CIPK系統(tǒng)在響應(yīng)低溫、干旱和高鹽等非生物逆境脅迫以及ABA和乙烯等信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有非常重要的作用。本實驗在克隆小麥TaCIPK16基因cDNA全長序列的基礎(chǔ)上主

2、要進(jìn)行了以下工作：
　?。?）首先在數(shù)據(jù)庫中搜索并拼接小麥TaCIPK16基因的ESTs序列，然后設(shè)計特異性RT-PCR引物，克隆得到TaCIPK16基因的cDNA全長。
　?。?）通過TaCIPK16基因序列分析發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白TaCIPK16含有N端的激酶結(jié)構(gòu)域、C端的NAF結(jié)構(gòu)域和PPI結(jié)構(gòu)域，屬于SnRK3類激酶。通過序列比對以及進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該基因和OsCIPK16基因的同源性最高，因此將其命名為TaCIPK16基

3、因。
　?。?）利用實時熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）分析了TaCIPK16基因在NaCl、PEG、H?O?、4℃低溫及ABA、ETH六種不同處理下的表達(dá)情況，結(jié)果表明TaCIPK16基因能夠被NaCl、PEG、ETH、H?O?處理誘導(dǎo)表達(dá)，說明該基因可能參與了鹽脅迫、干旱脅迫、乙烯脅迫和氧化脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為逆境脅迫響應(yīng)基因。
　?。?）構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGADT7-TaCIPK16，利用酵母雙雜交方法檢測了TaCIP

4、K16與TaCBLs在酵母體內(nèi)的相互作用。結(jié)果顯示TaCIPK16和目前已克隆的7個TaCBLs無相互作用。
　　（5）構(gòu)建小麥TaCIPK16基因的真核表達(dá)載體pBI121-TaCIPK16-GFP用于亞細(xì)胞定位分析和煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。利用基因槍技術(shù)對重組質(zhì)粒進(jìn)行瞬時表達(dá)，結(jié)果表明TaCIPK16-GFP融合蛋白分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pBI121-TaCIPK16-GFP轉(zhuǎn)化到煙草中，通過組培技術(shù)