小麥TaCIPK16基因的克隆、表達分析及遺傳轉化研究.pdf

1、近年來發(fā)現(xiàn)CBL蛋白（Calcineurin B-like protein）是植物所特有的一類Ca2+感受器，CIPK蛋白（CBL-interacting Protein Kinase）是與其相互作用的蛋白激酶，兩者共同組成 Ca2+-CBL-CIPK信號轉導系統(tǒng)。CBL-CIPK系統(tǒng)在響應低溫、干旱和高鹽等非生物逆境脅迫以及ABA和乙烯等信號分子的轉導中具有非常重要的作用。本實驗在克隆小麥TaCIPK16基因cDNA全長序列的基礎上主

2、要進行了以下工作：
　?。?）首先在數(shù)據(jù)庫中搜索并拼接小麥TaCIPK16基因的ESTs序列，然后設計特異性RT-PCR引物，克隆得到TaCIPK16基因的cDNA全長。
　　（2）通過TaCIPK16基因序列分析發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白TaCIPK16含有N端的激酶結構域、C端的NAF結構域和PPI結構域，屬于SnRK3類激酶。通過序列比對以及進化樹分析發(fā)現(xiàn)，該基因和OsCIPK16基因的同源性最高，因此將其命名為TaCIPK16基

3、因。
　?。?）利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）分析了TaCIPK16基因在NaCl、PEG、H?O?、4℃低溫及ABA、ETH六種不同處理下的表達情況，結果表明TaCIPK16基因能夠被NaCl、PEG、ETH、H?O?處理誘導表達，說明該基因可能參與了鹽脅迫、干旱脅迫、乙烯脅迫和氧化脅迫信號轉導，為逆境脅迫響應基因。
　　（4）構建酵母表達載體pGADT7-TaCIPK16，利用酵母雙雜交方法檢測了TaCIP

4、K16與TaCBLs在酵母體內的相互作用。結果顯示TaCIPK16和目前已克隆的7個TaCBLs無相互作用。
　　（5）構建小麥TaCIPK16基因的真核表達載體pBI121-TaCIPK16-GFP用于亞細胞定位分析和煙草的遺傳轉化。利用基因槍技術對重組質粒進行瞬時表達，結果表明TaCIPK16-GFP融合蛋白分布于細胞膜、細胞質和細胞核。利用農桿菌介導法將重組質粒pBI121-TaCIPK16-GFP轉化到煙草中，通過組培技術