普通小麥春化基因的克隆及表達(dá)特性分析.pdf

1、小麥的春化特性是決定小麥種植區(qū)劃、引種用種及栽培技術(shù)的重要因素之一，小麥品種冬春性的強(qiáng)弱直接影響到小麥的穗分化進(jìn)程及其對(duì)低溫凍害的耐受能力，開展小麥春化分子調(diào)控機(jī)理的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究以具有不同春化特性的9個(gè)代表性小麥品種為試驗(yàn)材料，系統(tǒng)分析了它們的發(fā)育特性、春化基因組成及表達(dá)特性，主要研究結(jié)果如下： 1、小麥春化基因VRN1的組成與春化發(fā)育特性。 在供試的9個(gè)品種中，低溫春化處理在不同程度上均可縮短小

2、麥的幼穗分化進(jìn)程和苗穗期，且小麥品種的春性越強(qiáng)，其對(duì)低溫的敏感性越低，冬性越強(qiáng)則對(duì)低溫春化的敏感性越高。在不同低溫春化處理?xiàng)l件下，遼春10號(hào)（Vrn-A1，Vrn-B1，Vrn-D1）和新春2號(hào)（Vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在5％以下，為春性品種，遼春10號(hào)的春性最強(qiáng)；豫麥18（vrn-A1，vrn-B1，Vrn-D1）和鄭麥9023（vrn-A1，Vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在5％～10％

3、以下，為弱春性品種；周麥18（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）和豫麥49-198（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在20％～24％之間，為半冬性品種；京841（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1新冬18（vrn-A1，Vrn-B1，vrn-D1）和肥麥（vrn-A1，vrn-B1，vrn-D1）苗穗期的變異系數(shù)在25％～32％之間，為冬性品種，肥麥的冬性最強(qiáng)。通過(guò)基因組特異性PCR鑒定及序列分析

4、，小麥品種的春化發(fā)育特性與春化基因Vrn1勺顯隱性組成密切相關(guān)，當(dāng)Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1均為顯性時(shí)，品種的春化發(fā)育特性為強(qiáng)春性，低溫春化效應(yīng)極低；當(dāng)Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1為隱性時(shí)，品種的春化發(fā)育特性為半冬性到強(qiáng)冬性，低溫春化效應(yīng)從弱到強(qiáng)；當(dāng)Vrn-A1或Vrn-B1或Vrn-D1為顯性時(shí)，品種的春化發(fā)育特性為春性，Vrn1顯性基因的春性效應(yīng)表現(xiàn)為Vrn-A1> Vrn-B1>Vrn-D1的趨勢(shì)，與品種

5、的春性強(qiáng)弱趨勢(shì)表現(xiàn)一致。 2、小麥春化基因VRN1的克隆和表達(dá)特性。 通過(guò)PCR特異擴(kuò)增技術(shù)克隆了春化基因VRN1的cDNA片段，序列分析顯示該基因的A、B和D等位基因間有差異，B和D基因組差異較小，A基因組與B和D基因組差異較大；VRN1基因在不同品種間差異較小，其序列有較高的保守性。通過(guò)特異性半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)VRN1的三個(gè)等位基因的表達(dá)特性分析顯示，強(qiáng)春性品種（遼春10號(hào)）的3個(gè)等位基因在1葉期（圓錐期）就有

6、較低水平的表達(dá)，從3葉期（二棱期）開始保持高水平表達(dá)至開花期；春性品種新春2號(hào)、弱春性品種豫麥18和鄭麥9023中，均有一個(gè)顯性等位基因（分別為Vrn-A1、Vrn-D1和VRN-B1）在1葉期（圓錐期）就啟動(dòng)表達(dá)，而另外兩個(gè)等位基因的表達(dá)則較滯后，這與其基因組成（分別為Vrn-A1vrn-B1 vrn-D1、vrn-A1 vrn-B1 Vrn-D1和vrn-A1 Vrn-B1vrn-D1）相一致；在半冬性（周麥18和豫麥49-198）

7、和冬性品種（京841和肥麥）中，三個(gè)等位基因均對(duì)低溫春化高度敏感，低溫春化的誘導(dǎo)效應(yīng)具有vrn-A1>vrn-B1>vrn-D1的趨勢(shì)。結(jié)果表明，VRN1基因的表達(dá)啟動(dòng)與等位基因的顯隱性組成密切相關(guān)，顯性等位基因的表達(dá)啟動(dòng)較早，而隱性等位基因則較滯后；低溫春化能夠誘導(dǎo)VRN1的表達(dá)；在通過(guò)春化階段后VRN1維持高水平的表達(dá)，并一直持續(xù)至開花期。 3、小麥春化基因VRN2的克隆和表達(dá)特性。 通過(guò)PCR特異擴(kuò)增技術(shù)克隆了春化

8、基因VRN2的兩個(gè)成員ZCCT1和ZCCT2，序列分析顯示該基因可編碼包含CCT結(jié)構(gòu)域的功能蛋白，基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該基因包含1個(gè)1249bp～1449 bp的內(nèi)含子。表達(dá)特性分析顯示，在強(qiáng)春性品種遼春10號(hào)中未檢測(cè)到其表達(dá)；在春性品種新春2號(hào)、弱春性品種豫麥18和鄭麥9023中，只有1葉期（圓錐期）有表達(dá)；在其它檢測(cè)的半冬性和冬性品種中，VRN2基因的表達(dá)與VRN1的表達(dá)互為消長(zhǎng)，即在通過(guò)春化階段以前表達(dá)，而在通過(guò)春階段后則停止表達(dá)，

9、停止表達(dá)時(shí)間與幼穗發(fā)育通過(guò)二棱期一致；VRN2基因的表達(dá)受低溫春化的抑制，因此在普通小麥中，不需要春化（強(qiáng)春性品種）或當(dāng)春化發(fā)育階段（春性、冬性品種）通過(guò)時(shí)，該基因即不表達(dá)或表達(dá)量極低。 4、小麥春化基因VRN3的序列特征和表達(dá)特性。 對(duì)VRN3基因的克隆和序列分析顯示，該基因在普通小麥中至少存在3個(gè)成員：其cDNA序列分析顯示該基因編碼的蛋白屬于磷脂結(jié)合蛋白（phospholipid-binding proteins）

10、家族成員，基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，該基因包含2個(gè)內(nèi)含子，且內(nèi)含子序列在品種間存在較大差異。通過(guò)特異性半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)VRN3的表達(dá)特性分析顯示，VRN3的表達(dá)特性有三種類型：即在圓錐期表達(dá)起始（遼春10號(hào)和豫麥18）；在伸長(zhǎng)期或單棱期開始表達(dá)（新春2號(hào)、鄭麥9023、京841和新冬18）；在二棱期之后起始表達(dá)（周麥18和豫麥49-198和肥麥）。結(jié)果表明，所有品種VRN3的表達(dá)持續(xù)至開花期：低溫誘導(dǎo)能夠誘導(dǎo)或增強(qiáng)小麥VRN3的表達(dá)

11、 5、小麥春化基因的時(shí)空表達(dá)特性。 VRN1在小麥根、莖稈、葉片、花藥、胚珠、發(fā)育過(guò)程的種子中均有不同水平的表達(dá)，而在干種子和種子萌發(fā)過(guò)程中不表達(dá)，不過(guò)在冬性品種中該基因的表達(dá)特性受春化進(jìn)程的影響。VRN2的表達(dá)與小麥的春化進(jìn)程密切相關(guān)，僅在小麥通過(guò)二棱期前的葉片中表達(dá)，而在其它發(fā)育時(shí)期的葉片及其它組織中均未檢測(cè)到其表達(dá)；VRN3的表達(dá)除了在根系中未檢測(cè)到外，其時(shí)空表達(dá)特性與VRN1相似。 從三個(gè)春化相關(guān)基因的表達(dá)

12、特性來(lái)看，VRN1基因隨小麥發(fā)育進(jìn)程及低溫誘導(dǎo)而表達(dá)，冬性越強(qiáng)，促進(jìn)表達(dá)所需要低溫誘導(dǎo)的時(shí)間越長(zhǎng)；VRN3的表達(dá)滯后于VRN1的表達(dá)，并與VRN1有相同的表達(dá)趨勢(shì)；VRN2基因在強(qiáng)春性品種中不表達(dá)，其它品種僅在幼穗分化通過(guò)二棱期前有較高水平的表達(dá)，二棱期后不管是冬性品種還是春性品種，該基因均不表達(dá)，而VRN1和VRN3均有較高水平的表達(dá)；推斷VRN1和VRN3基因是生殖生長(zhǎng)階段或開花過(guò)程必須的基因，其表達(dá)產(chǎn)物在生殖生長(zhǎng)中起重要作用。

13、 本研究的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在： （1）首次明確了我國(guó)不同小麥生態(tài)區(qū)代表品種的VRN1基因的顯隱性組成，及不同品種中3個(gè)春化基因VRN1、VRN2、VRN3的表達(dá)特性與小麥春化發(fā)育特性的對(duì)應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三個(gè)顯性Vrn1等位基因具有春性累加效應(yīng)，而且春性特性表現(xiàn)為Vrn-A1>Vrn-B1>Vrn-D1，是控制小麥春性強(qiáng)弱的分子基礎(chǔ)。 （2）明確了不同品種間3個(gè)春化基因VRN1、VRN2和VRN3基因序列的差異特征，發(fā)現(xiàn)VR

14、N1基因編碼區(qū)具有較高的保守性，在不同基因組和品種間VRN1序列差異主要在內(nèi)含子區(qū)，內(nèi)含子區(qū)差異是進(jìn)一步開發(fā)春化發(fā)育的分子標(biāo)記和品種特性鑒定的關(guān)鍵。 （3）進(jìn)一步明確了普通小麥中3個(gè)春化基因互作機(jī)理，顯性Vrn1控制春性發(fā)育特性，隱性vrn1控制冬性發(fā)育特性，VRN1和VRN3基因是生殖生長(zhǎng)階段或開花過(guò)程必需的基因，其表達(dá)產(chǎn)物在生殖生長(zhǎng)中起重要作用；顯性Vrn-A1不受VRN2的抑制表達(dá)較早，隱性vrn1的表達(dá)受VRN2的抑制，