基于小麥灌漿期熱脅迫轉(zhuǎn)錄組分析及三個(gè)耐熱相關(guān)基因的克隆、表達(dá)特征分析和遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本文基于小麥品種“中國春”“Triticum aestivumlL. Chinese Spring”灌漿期熱脅迫下旗葉組織轉(zhuǎn)錄組分析，篩選得到2429個(gè)熱脅迫應(yīng)答候選基因，同時(shí)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，選定了2個(gè)受高溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的基因TaG1和TaG12，以及1個(gè)受高溫抑制表達(dá)的基因TaG16進(jìn)行了深入研究，并通過RT-PCR技術(shù)克隆得到這3個(gè)基因的基因組序列和cDNA序列，并通過同源性氨基酸序列分析、組織表達(dá)和高溫脅迫應(yīng)答分析、植物表達(dá)載

2、體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化等方法，以期從上述基因的角度探索高溫脅迫下小麥的應(yīng)答機(jī)制，并獲得熱脅迫相關(guān)優(yōu)異基因資源，為小麥品種耐熱性狀改良提供指導(dǎo)和奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　1.通過對(duì)小麥品種“中國春”灌漿期高溫（38℃）8 h處理和適溫（24℃）對(duì)照下旗葉組織樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果顯示，對(duì)照及處理組有效序列標(biāo)簽（Clean tags）數(shù)目分別占總序列的百分比分別為96.74％和96.63%，并且對(duì)照和處理樣品所檢測(cè)到的基因數(shù)目已基本

3、飽和，完全符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析需求；隨后在完成樣品轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序之后，對(duì)高溫脅迫下小麥葉片組織中基因的高溫應(yīng)答情況進(jìn)行分析結(jié)果顯示，在檢測(cè)到的93003個(gè)基因中有1058個(gè)基因?qū)儆跓崦{迫誘導(dǎo)上調(diào)類型，1371個(gè)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)受高溫脅迫抑制。獲得2429個(gè)熱脅迫應(yīng)答候選基因，為研究小麥耐熱性機(jī)制獲得了大量的優(yōu)異基因資源。
　　2.根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，初步選定了2個(gè)受高溫誘導(dǎo)強(qiáng)烈表達(dá)的基因TaG1和TaG12，以及1個(gè)受高溫抑制表達(dá)的基因

4、TaG16進(jìn)行了深入研究。核酸序列及氨基酸序列分析表明，小麥TaG1基因cDNA序列全長546 bp、基因組全長1071 bp、開放讀碼框420 bp、含有4個(gè)內(nèi)含子、編碼139個(gè)氨基酸、氨基酸序列與節(jié)節(jié)草、短柄草、水稻來源的PSII10kD葉綠體蛋白氨基酸序列相似性分別為100%、89%和83%，說明小麥TaG1基因表達(dá)蛋白屬于植物PSII10kD葉綠體蛋白家族；小麥TaG12基因cDNA序列全長1297bp、基因組全長1297 bp

5、、開放讀碼框972 bp、無內(nèi)含子、編碼323個(gè)氨基酸、氨基酸序列與水稻、山羊草來源的未知蛋白氨基酸相似性分別為66%和60%，小麥TaG12基因表達(dá)蛋白功能還未發(fā)現(xiàn)；小麥TaG16基因cDNA序列全長1220 bp、基因組全長1756 bp、開放讀碼框1083 bp、含有1個(gè)內(nèi)含子、編碼360個(gè)氨基酸、氨基酸序列與黑麥草、山羊草來源的咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白相似性分別為83%和99%，說明小麥TaG16基因表達(dá)蛋白屬于植物咖啡酸-O

6、-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白家族。組織表達(dá)分析表明，TaG1基因在“中國春”各組織的表達(dá)量強(qiáng)弱順序分別為葉片、穎殼、莖、根和籽粒；TaG12基因的表達(dá)量強(qiáng)弱順序?yàn)槿~片、莖、籽粒、穎殼和根；TaG16基因的表達(dá)量強(qiáng)弱順序?yàn)楦⑶o、穎殼、葉片和籽粒，顯示出較強(qiáng)的組織特異性。高溫脅迫應(yīng)答分析表明，小麥TaG1和TaG12基因高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)模式，而TaG16基因的表達(dá)受高溫抑制。
　　3.為深入研究這3個(gè)耐熱候選基因的功能，通過構(gòu)建植物

7、表達(dá)載體并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化和種子萌發(fā)期熱脅迫表型鑒定。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了3個(gè)超量植物表達(dá)載體pCAMBIA3301::TaG1、pCAMBIA3301::TaG12和pCAMBIA3301::TaG16。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將上述基因?qū)胍吧蛿M南芥品種“Col-o”，經(jīng)特異性PCR鑒定及測(cè)序證實(shí)，外源目的基因已整合進(jìn)入受體擬南芥基因組，并且分別獲得轉(zhuǎn)TaG1基因植株15株、轉(zhuǎn)TaG12基因植株20株和轉(zhuǎn)TaG16基

8、因植株23株。種子萌發(fā)期高溫（45℃）脅迫下萌發(fā)率分析表明，3個(gè)轉(zhuǎn)TaG1基因擬南芥株系TaG1-1，TaG1-4和TaG1-7種子的萌發(fā)率與野生型“Col-o”萌發(fā)率間無顯著性差異（P>0.05）；轉(zhuǎn)TaG12基因的3個(gè)株系TaG12-2，TaG12-4和 TaG12-6擬南芥種子萌發(fā)率與野生型“Col-o”萌發(fā)率間差異顯著（P<0.05）；轉(zhuǎn) TaG16基因3個(gè)株系TaG16-1，TaG16-3和TaG16-5擬南芥種子萌發(fā)率與野生