泥蚶高通量轉(zhuǎn)錄組分析及生長(zhǎng)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、泥蚶(Tegillarca granosa)俗稱(chēng)血蚶，是江、浙、閩沿海居民喜食的海鮮佳品，是我國(guó)傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖貝類(lèi)之一，也是我國(guó)灘涂貝類(lèi)養(yǎng)殖的主要對(duì)象。近年來(lái)，隨著泥蚶人工育苗技術(shù)的突破和規(guī)模化養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，泥蚶養(yǎng)殖業(yè)呈快速發(fā)展趨勢(shì)，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。然而，與之不相適宜的是，目前泥蚶分子遺傳基礎(chǔ)薄弱、基因組序列信息匱乏、遺傳育種工作剛剛起步，嚴(yán)重影響功能基因開(kāi)發(fā)的進(jìn)程和分子育種實(shí)踐的開(kāi)展。為此，本研究利用新一代高通量454

2、測(cè)序技術(shù)對(duì)泥蚶不同組織器官和不同發(fā)育階段樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)對(duì)高質(zhì)量序列的拼接組裝和基因注釋?zhuān)l(fā)掘與生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)代謝、繁殖、抗病等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因，為后續(xù)開(kāi)展功能基因研究和分子育種實(shí)踐提供有價(jià)值信息；利用RACE和RT-PCR技術(shù)，對(duì)泥蚶生長(zhǎng)調(diào)控基因Smad3、BMP7、ERK2、GRB2和蛋白質(zhì)代謝基因LAP3進(jìn)行基因克隆和表達(dá)分析，研究它們與生長(zhǎng)的密切關(guān)系，篩選可作泥蚶良種選育的候選基因；從泥蚶轉(zhuǎn)錄組中批量開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證SS

3、R分子標(biāo)記，為群體遺傳分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、生長(zhǎng)性狀主效QTLs的精確定位等研究提供有力工具。主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.基于454 GS FLX高通量測(cè)序的泥蚶轉(zhuǎn)錄組分析
　　 應(yīng)用454高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)泥蚶4個(gè)組織和3個(gè)發(fā)育階段樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了1170337條高質(zhì)量序列，通過(guò)序列拼接得到17940個(gè)重疊群(isotig)和131980個(gè)單拷貝序列(singleton)，isotig平均長(zhǎng)度達(dá)到93

4、4bp，測(cè)序深度為5.6倍。對(duì)泥蚶拼接得到的isotig與Swiss-prot、Nr等公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，通過(guò)GO注釋對(duì)基因進(jìn)行分類(lèi)，KEGG注釋了解基因間的聯(lián)系和生物體的生化代謝網(wǎng)絡(luò)。從注釋的基因中鑒別出大量調(diào)控泥蚶肌肉、上皮、神經(jīng)、纖維等的生長(zhǎng)因子及受體，找到了與生長(zhǎng)相關(guān)的TGFβ信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路中的多個(gè)重要基因；查找到大量與生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和免疫等生產(chǎn)相關(guān)的候選基因，為后續(xù)開(kāi)展功能基因研究和分子育種實(shí)踐有重要價(jià)值。在泥

5、蚶轉(zhuǎn)錄組中，發(fā)現(xiàn)血紅素合成過(guò)程中的大部分關(guān)鍵酶，推瓣貝類(lèi)血紅蛋白合成的基本過(guò)程可能與脊椎動(dòng)物十分相似。另外，從泥蚶轉(zhuǎn)錄組中檢測(cè)到6338個(gè)SSR和20038個(gè)SNP候選標(biāo)記，為分子標(biāo)記的大規(guī)模開(kāi)發(fā)提供了重要資源。
　　 2.利用泥蚶轉(zhuǎn)錄組序列大量開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，并研究其引物在毛蚶中的通用性
　　 EST文庫(kù)篩查法是目前大量開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的重要方法，具有方法簡(jiǎn)便、花費(fèi)低廉等優(yōu)點(diǎn)。本研究從泥蚶454轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的大量iso

6、tig和singleton序列中搜索到6338個(gè)SSR位點(diǎn)，可用于大規(guī)模開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記。在3828條isotig序列里，共檢測(cè)到138條適合設(shè)計(jì)引物的序列，擴(kuò)增得到81個(gè)穩(wěn)定擴(kuò)增的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在泥蚶奉化群體中進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，共擴(kuò)增出242個(gè)等位基因，各位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～9個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生3.90個(gè)等位基因，觀測(cè)雜合度為0.040～1.000，期望雜合度為0.040～0.844，多態(tài)信息含量為0.038～0.806。33個(gè)SSR

7、來(lái)自注釋基因序列，對(duì)這些基因的準(zhǔn)確定位有很大幫助。用62對(duì)泥蚶多態(tài)性SSR引物在毛蚶中進(jìn)行了通用性驗(yàn)證，結(jié)果有22對(duì)成功擴(kuò)增，16對(duì)表現(xiàn)為多態(tài)，這些多態(tài)位點(diǎn)可作為毛蚶和泥蚶的通用性標(biāo)記。
　　 3.泥蚶Smad3基因的克隆與表達(dá)分析
　　 Smad3是TGF-β通路的重要成員，可將信號(hào)分子從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核，是重要的生長(zhǎng)調(diào)控因子。利用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到泥蚶Smad3基因2341bp的cDNA全長(zhǎng)，編碼423個(gè)氨

8、基酸。蛋白質(zhì)功能域分析表明，Tg-Smad3含有兩個(gè)保守功能域MH1和MH2。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與脊椎動(dòng)物的同源性達(dá)到80％以上，說(shuō)明Tg-Smad3氨基酸序列十分保守。RT-PCR結(jié)果表明，Tg-Smad3在泥蚶各成體組織都有表達(dá)，其中足和血液中表達(dá)量最高，可能與細(xì)胞增殖和免疫過(guò)程有關(guān)；在早期發(fā)育階段，Tg-Smad3的表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢(shì)，在D形幼蟲(chóng)時(shí)期表達(dá)量最高，推測(cè)其參與貝殼的形成過(guò)程。
　　 4.泥蚶BMP7基因

9、的克隆與表達(dá)分析
　　 BMP7也是TGF-β通路中的重要成員，在生物體內(nèi)具有重要且廣泛的生物功能，參與骨骼的生長(zhǎng)、代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，并在生殖系統(tǒng)的生長(zhǎng)、發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究克隆得到Tg-BMP7基因的cDNA全長(zhǎng)，開(kāi)放閱讀框?yàn)?275bp，編碼425個(gè)氨基酸。功能域預(yù)測(cè)表明，Tg-BMP7是一個(gè)糖蛋白，包含由29個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，3個(gè)二硫鍵，并有一個(gè)TGF-β家族信號(hào)。RT-PCR結(jié)果顯示，Tg-BM

10、P7在成貝外套膜和鰓中表達(dá)量高；在早期發(fā)育階段中，D形幼蟲(chóng)的表達(dá)量顯著高于原腸胚、擔(dān)輪幼蟲(chóng)和幼貝，推測(cè)Tg-BMP7可能參與貝殼的形成過(guò)程，并具有組織分化、調(diào)控胚胎生長(zhǎng)發(fā)育等生理功能。
　　 5.泥蚶ERK2基因的克隆與表達(dá)分析
　　 ERK2是MAPK家族重要的反應(yīng)激酶系統(tǒng)，主要參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞周期調(diào)控等生理功能。泥蚶ERK2基因cDNA全長(zhǎng)1673bp，編碼359個(gè)氨基酸，功能域預(yù)測(cè)找到一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸

11、蛋白激酶的活性區(qū)域，這是ERK家族蛋白的特征性區(qū)域。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Tg-ERK2蛋白與脊椎動(dòng)物的同源性達(dá)到80％以上，說(shuō)明該基因十分保守，可能功能與脊椎動(dòng)物有類(lèi)似之處。RT-PCR結(jié)果表明，Tg-ERK2在泥蚶各組織、各個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá)，說(shuō)明Tg-ERK2功能強(qiáng)大，參與到多種生命活動(dòng)中去；相對(duì)而言，Tg-ERK2在泥蚶成體的血液中表達(dá)量最高；而在早期發(fā)育階段中表達(dá)量逐漸升高，D形幼蟲(chóng)期達(dá)到最高，這可能與此期細(xì)胞分化

12、加劇、神經(jīng)細(xì)胞形成較多有關(guān)。
　　 6.泥蚶GRB2基因的克隆與表達(dá)分析
　　 GRB2蛋白是一個(gè)重要的接頭分子，參與細(xì)胞內(nèi)各種受體激活后的下游調(diào)節(jié)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。Tg-GRB2基因全長(zhǎng)1275bp，編碼236個(gè)氨基酸。Tg-GRB2蛋白包含3個(gè)功能域，1個(gè)SH2和2個(gè)SH3，這是GRB2發(fā)揮生理功能的活性區(qū)域。Tg-GRB2在泥蚶不同組織中的表達(dá)量由大到小依次為：血液>足>鰓>外套膜>閉殼肌>內(nèi)臟團(tuán)；在早期發(fā)育

13、階段中，GRB2基因在原腸胚、擔(dān)輪幼蟲(chóng)、D形幼蟲(chóng)中均有較高的表達(dá)量，原因可能是隨著胚胎發(fā)育過(guò)程的進(jìn)行，細(xì)胞分裂速度加快，生命活動(dòng)旺盛，信號(hào)傳導(dǎo)需要較多的接頭蛋白
　　 7.泥蚶蛋白質(zhì)代謝基因LAP3的克隆與表達(dá)分析
　　 LAP3是M17類(lèi)蛋白家族的一員，在細(xì)胞成熟、細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)損傷防御、維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用。Tg-LAP3基因全長(zhǎng)為1590bp，編碼530個(gè)氨基酸，包括Peptidase_M17超家族序列