雜色鮑MNK、IRR和FGFR基因的克隆、表達分析及與生長相關的SNP位點篩查.pdf

1、雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國南方重要的養(yǎng)殖鮑種，研究與雜色鮑生長相關的基因，分析基因的表達規(guī)律，并篩查基因中與生長性狀相關聯(lián)的SNP位點，對于深入了解生長性狀調(diào)控的分子機制，培育具有優(yōu)良性狀的新品種具有重要意義。本研究將MAPK互作激酶(MAP kinase-interacting kinase，MNK)、胰島素相關多肽受體(Insulin-related peptide receptor, IRR)和成纖

2、維細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptor, FGFR)三個基因作為雜色鮑生長的候選基因，通過對其克隆、功能驗證、SNP位點檢測及與生長性狀的關聯(lián)分析，篩選出對雜色鮑生長性狀有重要影響的功能分子標記，以期為雜色鮑的分子標記輔助選擇育種提供重要依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　1、利用PCR及末端快速擴增技術(shù)（RACE）技術(shù)，克隆獲得MNK基因的cDNA全長序列及開放閱讀框（ORF）區(qū)域的基因組D

3、NA序列。MNK基因cDNA全長3576bp，ORF長1413bp，ORF區(qū)的基因組DNA序列長3942bp，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子。熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示，MNK基因在所測的幼體/胚胎不同發(fā)育階段及成體不同組織都有表達，胚胎時期表達量顯著高于破膜后幼體時期的表達量，在成體精巢組織中表達量最高，在鰓中表達量最低。通過整體原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，MNK基因在原腸胚時期至圍口殼幼體時期均有表達，擔輪幼體時期和面盤幼體早期，M

4、NK基因主要在殼腺區(qū)域表達，面盤幼體中期主要在內(nèi)臟團和貝殼處表達，面盤幼體后期，表達部位分布在內(nèi)臟團和外套膜區(qū)，到達圍口殼幼體時期，開始在消化腺、外套膜和足部大量表達。利用高通量測序手段在6個包含MNK外顯子的片段中共篩選獲得了5個與雜色鮑生長性狀相關的SNP位點。選擇與足肌重量和殼的生長性狀均顯著相關的位點A1748C，分析MNK基因在該位點三種基因型的足肌和外套膜中表達量的相互關系，發(fā)現(xiàn)足肌重量及殼長、殼寬、殼高、殼重值最高的CC型

5、個體中MNK基因在足肌和外套膜中的表達量最高，而生長性狀平均值最低的AA型個體，MNK基因在足肌和外套膜中的表達量最低，說明A1748C中等位基因C可能促進足肌肉及殼的生長。
　　2、利用PCR技術(shù)及RACE技術(shù)，克隆獲得IRR基因的cDNA全長序列及 ORF區(qū)的部分基因組DNA序列。IRR基因cDNA全長5723bp，ORF長3054bp，已獲得的ORF區(qū)的部分基因組DNA包含18個外顯子。通過qRT-PCR檢測了IRR基因在雜

6、色鮑胚胎/幼體不同發(fā)育時期及成體不同組織的表達情況，發(fā)現(xiàn)雜色鮑IRR基因在幼體各發(fā)育階段都有表達，在胚胎發(fā)育時期表達量較高，原腸胚時期和早期擔輪幼體時期達到最高，擔輪幼體時期表達量有所降低，從面盤幼體時期至圍口殼幼體時期，表達量顯著下降。IRR基因在成體各組織中均有表達，在精巢中表達量最高，在卵巢中表達量最低。整體原位雜交結(jié)果顯示，IRR基因從原腸胚時期開始表達，擔輪幼體期，IRR基因在后毛輪區(qū)表達，面盤幼體早期，開始在殼腺處表達，面盤

7、幼體中期，表達部位分布在內(nèi)臟團和貝殼處，至面盤幼體后期，信號增強，主要集中于內(nèi)臟團區(qū)，到達圍口殼幼體時期，IRR基因在消化腺表達量減少，并開始在外套膜和足部表達。利用高通量測序手段在18個包含IRR外顯子的片段中共篩選獲得了17個與雜色鮑生長性狀相關的SNP位點。其中8個位點與所測的雜色鮑性狀均明顯相關，其余位點與一個或幾個生長性狀相關聯(lián)。選擇與足肌重量和殼的生長性狀均顯著相關的A2198T位點，分析IRR基因在該位點三種基因型的足肌和

8、外套膜中表達量的相互關系，發(fā)現(xiàn)足肌重量及殼長、殼寬、殼高、殼重值最高的AA型個體中，IRR基因在足肌和外套膜中表達量最高，而生長性狀平均值最低的TT型個體，IRR基因在足肌和外套膜中的表達量最低。進一步驗證了A2198T位點與雜色鮑生長性狀的相關性。
　　3、利用普通PCR技術(shù)及RACE技術(shù)獲得了FGFR基因的cDNA全長序列及ORF區(qū)的部分基因組DNA序列。FGFR基因cDNA全長5059 bp，ORF長3729bp，ORF區(qū)基

9、因組DNA中的外顯子已全部獲得，共包含23個外顯子。通過qRT-PCR檢測了FGFR在雜色鮑胚胎/幼體不同發(fā)育時期及成體不同組織的表達情況，發(fā)現(xiàn)FGFR基因在所測的幼體/胚胎不同發(fā)育階段均有表達，在受精卵時期表達量較高，2細胞期開始降低，至圍口殼幼體時期表達量又顯著升高。在雜色鮑成體各組織中，F(xiàn)GFR基因在鰓、外套膜、肝胰腺、足肌、精巢組織中均有表達，其中，鰓和外套膜中表達量最高，而在卵巢和血淋巴中幾乎不表達。利用高通量測序手段在24個