雜色鮑抗副溶血弧菌血細胞ESTs分析及免疫功能基因的克隆.pdf

1、本文以本實驗室構(gòu)建的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染的雜色鮑(Haliotisdiversicolor)血細胞cDNA文庫為材料,對文庫進行擴增并經(jīng)隨機篩選后共測序4758條序列,經(jīng)生物信息學初步處理后得到高質(zhì)量的表達序列標簽(Expressed Sequence Taqs,ESTs)4264條。拼接后獲得3638條唯一序列(unique sequences),其中重疊群(contigs)和單一序列(si

2、nglets)分別為484條和3154條;冗余率為14.68％。3638條唯一序列用Blast2go軟件進行注釋。Blast注釋后,發(fā)現(xiàn)有398條(10.9％)EST在GenBank的非冗余蛋白庫找到了同源序列。GO注釋后發(fā)現(xiàn)這398個基因聚類有340個可歸類于細胞組分、生物學過程和分子功能。InterProScan注釋后,發(fā)現(xiàn)有950條序列可以找到同源序列,其中71條獲得了酶學編碼。將獲得了酶學編碼的71條序列在KEGG中的Pathw

3、ay數(shù)據(jù)庫進行注釋,發(fā)現(xiàn)參與代謝途徑和氧化磷酸化的序列最多。我們對具有同源序列的基因進行了人工功能分析,發(fā)現(xiàn)了35種(8.8％)與免疫相關(guān)的基因。結(jié)合EST序列分析、SMART RACE技術(shù)和基因組步移(Genome Walking)技術(shù)獲得雜色鮑(small abalone)半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine proteases inhibitor或cystatin,CP

4、I)和脂多糖誘導的腫瘤壞死因子a因子(LPS-induced TNF-a factor,LITAF)基因的全長cDNA,分別命名為sacp、sacpi和salitaf,之后用head to toe PCR檢測cDNA序列開放閱讀框的正確性,并采用實時定量PCR分析這些基因的組織表達及經(jīng)副溶血弧菌感染后的表達情況。結(jié)果如下:1)雜色鮑sacp cDNA全長1558bp,開放閱讀框編碼303個氨基酸,包含兩個CP活性位點。經(jīng)Blast同源性

5、分析,發(fā)現(xiàn)其為組織蛋白酶(cathepsin)L型。2)雜色鮑sacpi序列全長1481bp,編碼253個氨基酸,包含一個CPI特征基序及Ⅱ型CPI激活位點的共有序列:Gly63,Q84VVSG88和P114W115。經(jīng)TFSEARCH在線預(yù)測,雜色鮑sacpi的5'側(cè)翼序列存在HSF、BR-C Z3、NIT2、Oct-1、CdxA、MyoD、deltaEF1、ADR1、MATal、GATA-1、C/EBPbeta、SRY和Sox-5等

6、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。3)salitaf基因cDNA序列全長為726bp,開放閱讀框編碼78個氨基酸,包含兩個LITAF特征性的N-端、C-端Zn2+結(jié)合域。4)sacp基因在性腺、鰓、肝胰腺、外套膜、上足、肌肉和血細胞七個組織中均有表達,在性腺、鰓和肝胰腺中,表達量最高。Sacpi基因主要在性腺和肝胰腺中表達,在其他組織中不表達或表達量很低。Salitaf基因在七個組織中都有表達,在鰓中的表達量最高,其次是上足和外套膜。5)弧菌感染后24

7、h,sacp基因在肝胰腺顯著上調(diào)表達(p＜0.05),感染48h后,表達量回降;sacpi基因在感染48h后,在肝胰腺顯著上調(diào)表達(p＜0.05),提示了sacpi對sacp的內(nèi)源性抑制;而satitaf基因感染48h后,在肝胰腺顯著上調(diào)表達(p＜0.05),96h后,顯著下調(diào)表達(p＜0.05)。6)感染弧菌后sacp基因在血細胞中的表達,各個時相實驗組和對照組都沒有顯著性差異(p＞0.05)。感染8h后,salitaf基因在血細胞中