副溶血弧菌tdh、trh和tlh基因的克隆、表達及其基因敲除對其溶血活性的影響.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是我國海水養(yǎng)殖魚、蝦、貝類的重要病原,每年由此菌引起的弧菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的損失。VP的主要致病因子是其產(chǎn)生的多種溶血毒素,主要有耐熱直接溶血毒素(thenmostable direct hemolysin,TDH),相對耐熱直接溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH),不耐熱溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)。本實驗

2、從VP基因組DNA中擴增出tdh、trh和tlh 3個基因,并利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對其進行了表達,純化的融合蛋白經(jīng)復(fù)性后具有溶血活性;同時,構(gòu)建了基因打靶載體的骨架質(zhì)粒pMO18-T-neo,對3個基因分別進行了基因敲除研究,篩選到三株基因缺失株并對其溶血活性進行了檢測,結(jié)果表明單獨敲除3個基因中的任何一個均不能夠影響菌株的溶血活性。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)利用PCR技術(shù)從VP基因組DNA中擴增出tdh、trh

3、和tlh基因,并成功將3個基因克隆到大腸桿菌原核表達載體pET-28a(+)上,構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒;經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳證明3個外源基因均發(fā)生了表達,表達產(chǎn)物分別為27 kDa、27 kDa和50 kDa的融合蛋白,與推測的理論產(chǎn)物大小一致。經(jīng)Western blotting鑒定VP抗體能與純化的TDH、TRH和TLH蛋白發(fā)生特異反應(yīng),說明3個溶血毒素基因在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達是準確的。經(jīng)溶血活性檢測復(fù)性蛋白TDH

4、、TRH具有溶血活性,TLH在卵磷脂存在下也出現(xiàn)了溶血現(xiàn)象。
　　 (2)為了正確構(gòu)建出基因打靶載體的骨架質(zhì)粒,從真核表達載體pEGFP-N1上擴增出含有自身啟動子的新霉素抗性基因(neor)的DNA片段,并將其插入克隆載體pMD18-T中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-neo。
　　 (3)克隆打靶載體的長、短臂基因,在tdh,trh和tlh三個基因的同源短臂和同源長臂引物的5'端分別引入酶切位點,以便連入打靶載體。選

5、擇兩種不同的方法將長、短臂基因連入打靶載體,其一:首先將骨架質(zhì)粒pMD18-T-neo分別單酶切,接著把用堿性磷酸酶CIAP處理過的骨架質(zhì)粒與短臂連接,然后按照類似的方法再連入前臂。其二:將骨架質(zhì)粒pMD18-T-neo雙酶切,回收大片段pMD18-T,然后再雙酶切小片段neor基因,最后將這兩個片段與長、短臂基因用T4DNA連接酶連接。構(gòu)建好的基因打靶載體線性化后,用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入副溶血弧菌中,經(jīng)新霉素抗性平板篩選,抗性轉(zhuǎn)化子利用PC

6、R鑒定方法篩選tdh,trh和tlh基因缺失株。將tdh、trh和tlh三個基因缺失株接種到5％的兔血瓊脂平板上進行溶血性檢測,結(jié)果這三個基因缺失株在兔血平板上都能夠引起溶血,這說明單獨敲除副溶血弧菌3個基因中的任何一個均不能夠影響菌株的溶血活性,但tlh基因缺失株接種到5％的馬血瓊脂平板,結(jié)果未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,說明砌基因敲除成功。
　　 本實驗對副溶血弧菌的3個溶血基因tdh、trh和tlh進行克隆、表達,并用純化的蛋白制備了多