廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌毒力基因檢測及tlh基因的克隆與表達.pdf

1、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，VP）是我國沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要病原菌之一，廣泛存在于海水和海產(chǎn)品中，因致病性副溶血弧菌暴發(fā)性增殖引發(fā)的水生動物疾病每年都會給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。在我國，由副溶血弧菌污染引起的微生物食源性疾病居首位，廣西位于我國南部地區(qū)，海產(chǎn)品消費量大，人們喜歡食用生的或者半生熟的海產(chǎn)品，因此副溶血弧菌是引起廣西地區(qū)食物中毒最主要的病原菌。耐熱直接溶血毒素（Thermostable d

2、irecthemolyticus，TDH）、相對耐熱直接溶血素(TDH-relatedhemolysin，TRH)和不耐熱溶血素(Themolabile hemolysion，TLH)是副溶血弧菌的主要毒力因子，能產(chǎn)生多種溶血素，分別由tdh、trh和tlh基因編碼。本研究分別從廣西沿海的欽州、北海和防城港3市采集160份凡納濱對蝦病樣，進行副溶血弧菌的分離、鑒定以及藥物敏感性試驗，用PCR方法對tdh，trh和tlh毒力基因進行檢測，

3、并成功表達了tlh毒力基因，為蛋白純化、抗體制備及蛋白性質(zhì)研究等領域打下基礎，也為副溶血弧菌感染的監(jiān)控和防治提供技術(shù)支撐。獲得的主要結(jié)果有:
　　1.通過常規(guī)方法進行細菌分離，運用API細菌鑒定系統(tǒng)和16SrRNA基因序列分析對細菌進行生化鑒定和分子鑒定。從160份樣本中共檢出副溶血弧菌67株，檢出率為41.88％;利用Blast分析了67株分離菌株的16S rRNA基因序列，與GenBank中已經(jīng)登錄副溶血弧菌相應序列的同源性進

4、行比對，結(jié)果顯示，67株分離菌株之間高度同源，相似性99.2％～100％，67株分離菌株與副溶血弧菌標準菌株ATCC17802(NR114632.1)的親緣關(guān)系最近，相似性98.8％～100％。藥物敏感性試驗結(jié)果表明，67株副溶血弧菌對復達欣、菌必治、復方新諾明、舒普深、氟哌酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、特治星和氟苯尼考12種藥物的敏感率在80％以上，青霉素G、氨芐青霉素、磺胺二甲嘧啶、鹽酸沙拉沙星和磺胺-6-甲

5、氧嘧啶5種抗生素對67株副溶血弧菌的抑菌能力非常弱，表現(xiàn)出很強的耐藥性。
　　2.應用PCR方法對67株副溶血弧菌進行tdh、trh和tlh毒力基因檢測，檢測結(jié)果，67株副溶血弧菌的tdh和trh毒力基因均為陰性，tlh毒力基因均為陽性。
　　3.將擴增得到的tlh基因克隆到大腸桿菌原核表達載體pET-28a上，構(gòu)建重組表達載體pET-28a-tlh，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE電