微囊藻毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦體液免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、微囊藻毒素（MCs）是一類具有生物活性的單環(huán)七肽肝毒素，目前已知的異構(gòu)體超過80余種，其中毒性較強(qiáng)，研究較多的一種便是MC-LR。由于其能夠長時(shí)間存留在水體中，并能夠在生物體內(nèi)累積，對(duì)人類飲水安全和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)都提出了挑戰(zhàn)。因此，目前的研究較多集中于水體中MC-LR的檢測和MC-LR細(xì)胞毒性等兩方面。
　　凡納濱對(duì)蝦作為我國的主要經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物，在養(yǎng)殖過程中常常受到藍(lán)藻水華爆發(fā)的影響，水華產(chǎn)生的微囊藻毒素使得對(duì)蝦大規(guī)模死亡，水產(chǎn)行業(yè)

2、受到極大的影響。目前已知的研究證明微囊藻毒素可以影響浮萍[1]、大型溞[2]、克氏原螯蝦[3]和白鰱[4]等多種水生生物的生理活動(dòng)，甚至導(dǎo)致死亡。凡納濱對(duì)蝦同樣作為受到MC直接影響的物種，MC對(duì)其造成影響的途徑及毒性機(jī)理卻尚不明晰。本研究通過第二代高通量測序、qRT-PCR等技術(shù)手段試圖尋找到MC-LR對(duì)凡納濱對(duì)蝦體液免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響情況及其致毒機(jī)理。
　　在對(duì)健康成蝦分別注射MC-LR溶液和等量PBS溶液12 h后，采集

3、足量的對(duì)蝦肝胰腺和血液樣品，RNA抽提后得到總RNA樣品。將樣品進(jìn)行mRNA純化，分解成小片段，PCR擴(kuò)增構(gòu)建文庫等一系列操作之后，通過Illumina HiSeq2000高通量測序進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建和表達(dá)譜分析。在所構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫中，共得到轉(zhuǎn)錄本30,587條，平均長度為1,402.66 bp，GO功能注釋后共有7,175條轉(zhuǎn)錄本得到了相應(yīng)的功能注釋，可歸類到生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（ce

4、llular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）三個(gè)二級(jí)分類中。通過BLAST軟件比對(duì)COG和KEGG數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)：共有4,588條轉(zhuǎn)錄本在COG數(shù)據(jù)庫中得到了相應(yīng)注釋，5,327條轉(zhuǎn)錄本在KOG數(shù)據(jù)庫中得到了相應(yīng)注釋，77條轉(zhuǎn)錄本在NOG數(shù)據(jù)庫中得到了注釋；共有7,955條轉(zhuǎn)錄本在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到了注釋，分別屬于311個(gè)已知的信號(hào)通路中。表達(dá)譜分析結(jié)果顯示：在肝胰腺中共有880條

5、差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，包含89個(gè)差異表達(dá)基因，存在表達(dá)差異的基因多為抗氧化酶類基因；血液中共有212條差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，包含21個(gè)差異表達(dá)基因，存在表達(dá)差異的基因多為淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫相關(guān)基因。兩種組織間表達(dá)差異的基因存在明顯的不同。同時(shí)在肝胰腺中存在極個(gè)別顯著富集的KEGG PATHWAY通路基因，可造成凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)鞘脂類代謝失調(diào)，可能是MC導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦免疫系統(tǒng)受損，抗病力下降的新途徑，值得我們深入探究。
　　在以往的研究中

6、，對(duì)蝦體液免疫主要包括酚氧化酶原激活系統(tǒng)、凝集素等，而抗菌肽作為一種具有廣譜性殺菌效力的生物大分子，近年來得到了越來越多的研究。目前已知的對(duì)蝦抗菌肽可大致分為三類（Penaeidin、Crustin和ALF），MC誘導(dǎo)情況下抗菌肽基因的表達(dá)量變化情況及其抗菌性變化情況尚未人進(jìn)行研究。本研究通過 qRT-PCR技術(shù)分析了 MC-LR注射后凡納濱對(duì)蝦體內(nèi) Penaeidin3、Crustin、ALF等三種抗菌肽的表達(dá)量變化情況，證明了MC-