微囊藻毒素對凡納濱對蝦細胞免疫相關基因表達水平的影響.pdf

1、微囊藻毒素（Microcystin, MCs）是藍藻水華最常見的一種藻毒素，常在高溫季節(jié)發(fā)生在淡水湖泊及養(yǎng)殖池塘中，對生活于水體中的水生生物造成了極大的影響，對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了極大的危害。微囊藻毒素是一種肝毒素，主要靶器官為動物的肝臟。有研究表明在凡納濱對蝦池塘中，銅綠微囊藻等藍藻形成優(yōu)勢種與蝦病暴發(fā)呈正相關，對蝦發(fā)病池呈現(xiàn)硅藻到藍藻優(yōu)勢的演替。而在生產(chǎn)中，養(yǎng)殖中后期的蝦池，也經(jīng)常爆發(fā)藍藻水華，導致蝦類原因不明的死亡。暴露于一定濃度銅綠微

2、囊藻的克氏原螯蝦、凡納濱對蝦和羅氏沼蝦幼蝦存活率顯著降低，外觀顏色及超微結構有明顯變化。
　　凡納濱對蝦俗名南美白對蝦，是當今世界養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量最高的三大品種之一（斑節(jié)對蝦P.monodon、凡納濱對蝦L.vannamei和中國對蝦F.chinensis）。它具有食性雜、生長快、繁殖力強、成活率高、易于飼養(yǎng)且營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，所以深受養(yǎng)殖戶及消費者的喜愛。但由于對蝦爆發(fā)性疾病的危害使其養(yǎng)殖面臨極高的養(yǎng)殖風險。雖然經(jīng)過科學家、政府和企

3、業(yè)的不懈努力下恢復了一定的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低了養(yǎng)殖風險，但對蝦流行性疾病仍是懸在養(yǎng)殖戶心頭的一把利劍。因此，深入開展凡納濱對蝦免疫防御機制的相關研究，探索免疫防治新途徑，對實現(xiàn)其健康養(yǎng)殖和疾病控制有重大意義。
　　本文就目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，對甲殼動物的免疫防御機制進行綜述，分析了甲殼動物細胞免疫及體液免疫等免疫過程的免疫機制及其免疫相關的基因和蛋白。通過對凡納濱對蝦進行血竇注射微囊藻毒素MC-LR染毒，獲取其肝胰腺及血液組織樣品，采用

4、Illumina Hiseq2500測序方法獲得了凡納濱對蝦在注射微囊藻毒素前后血液及肝胰腺的轉錄組，從微囊藻毒素對蝦類肝胰腺和血淋巴細胞免疫毒性作用著手，探討微囊藻毒素對蝦類的毒性機理。并利用流式細胞儀檢測注射微囊藻毒素后的凡納濱對蝦細胞凋亡現(xiàn)象，探討微囊藻毒素注射凡納濱對蝦過程中對蝦肝胰腺細胞中的細胞凋亡現(xiàn)象。并利用激光共聚焦技術觀察驗證細胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。研究結果如下：
　?。?）在血液和肝胰腺樣本中分別發(fā)現(xiàn)了有顯著性差異表

5、達的基因序列，經(jīng)過確定其中包括血液樣本中的血小板反應蛋白（thrombospondin）和細胞周期素B（cyclin B）兩種基因，肝胰腺樣本中的酚氧化酶原（prophenoloxidase）、胰蛋白酶（trypsin）及 C型凝集素（C-type lectin）等10種基因。在轉錄本出現(xiàn)顯著性表達差異結果中沒有明顯的細胞免疫范疇基因出現(xiàn)，酚氧化酶原及 C型凝集素等都屬于體液免疫范疇，不過在對蝦免疫系統(tǒng)中細胞免疫和體液免疫本身就相互作用

6、，密不可分。
　?。?）GO顯著性差異表達結果證實了在血液樣本組中存在細胞粘附、細胞殺傷及細胞粘附分子結合物等細胞免疫相關基因表達。在肝胰腺樣本組中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細胞免疫相關的GO顯著差異性表達，但值得一提的是其中有不少氧化還原酶及蛋白質(zhì)代謝相關的GO顯著性差異表達。KEGGPATHWAY顯著性差異表達結果表明，在血液樣本組和肝胰腺樣本組中都存在吞噬體（Phagosome）、細胞凋亡（Apoptosis）、內(nèi)吞作用（Endocyt

7、osis）和細胞粘附分子（Cell adhesion molecules（CAMs））等通路。
　?。?）流式細胞儀檢測PI單染的微囊藻毒素注射凡納濱對蝦肝胰腺細胞的實驗結果證明在注射微囊藻毒素后有明顯的細胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生，在12h內(nèi)緩慢增長，12至24h增長較快，24h后這個趨勢明顯的放緩了。實驗結果證實了在微囊藻毒素感染的情況下凡納濱對蝦細胞凋亡現(xiàn)象的存在，并且與注射后感染時間存在一定的關系。
　　（4）激光共聚焦觀察細胞