KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因時(shí)空表達(dá)的影響.pdf

1、我們前期研究證明,咪唑類(lèi)物質(zhì)KK-42處理凡納濱對(duì)蝦(Penaeus sehmitti)幼蝦,能顯著促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),但作用機(jī)理并不清楚。凡納濱對(duì)蝦等甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育是通過(guò)周期性蛻皮來(lái)實(shí)現(xiàn),其過(guò)程由甲基法呢酯(MF)和蛻皮激素(MH)協(xié)同分級(jí)調(diào)控。物質(zhì)積累是動(dòng)物生長(zhǎng)的前提和基礎(chǔ),為蛻皮提供物質(zhì)和能量。本論文以凡納濱對(duì)蝦為材料,研究了KK-42對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因時(shí)空表達(dá)的影響,結(jié)合測(cè)定血淋巴MF和MH滴度,旨在從分子水平探討KK-42促

2、生長(zhǎng)的機(jī)制。
　　 采用浸潤(rùn)法,用1.95×10-4 mol/L的KK-42對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦(體長(zhǎng)3.5-5.0 cm)進(jìn)行處理,浸潤(rùn)時(shí)間為1 min,然后按正常方法飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中定期采樣,解剖取其不同組織,在不同時(shí)間抽取血淋巴。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平;采用正相、反相高效液相色譜分別檢測(cè)血淋巴中MF和MH的滴度。
　　 結(jié)果如下:
　　 KK-42處理之后,肝胰腺胰蛋白酶mRNA水平在

3、前6天升高＞42.6％(P＜0.05),之后恢復(fù)到對(duì)照組水平;從第1-7天,血藍(lán)蛋白mRNA水平增加＞54.6％(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)期間,組蛋白酶L mRNA含量＞51.9％(P＜0.05),幾丁質(zhì)酶mRNA水平升高＞56.1％;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶mRNA量前6天升高＞135.5％(P＜0.01),之后回到對(duì)照水平。KK-42可顯著下調(diào)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的表達(dá),與對(duì)照組相比,mRNA水平分別減少51.9％和57.

4、2％以上。
　　 首次從凡納濱對(duì)蝦肝胰腺分離出HSP90全基因序列,該基因cDNA2543 bp,開(kāi)放閱讀框2160 bp,編碼720個(gè)氨基酸。氨基酸殘基中含有HSP90保守結(jié)構(gòu)域,與已知的節(jié)肢動(dòng)物HSP90基因結(jié)構(gòu)一致。與其它物種HSP90蛋白進(jìn)行同源性比對(duì),與甲殼動(dòng)物蝦類(lèi)同源關(guān)系最近,其次是昆蟲(chóng),而和脊椎動(dòng)物HSP90同源關(guān)系較遠(yuǎn)。研究發(fā)現(xiàn),hsp90和hsp70在凡納濱對(duì)蝦不同組織都有表達(dá),其中肝胰腺中表達(dá)水平較高。實(shí)驗(yàn)期

5、間,肝胰腺中兩種HSP mRNA水平雖有一定波動(dòng),但含量相對(duì)較低;KK-42處理可顯著誘導(dǎo)HSP70和HSP90的表達(dá),處理后第1-3天,HSP70和HSP90 mRNA含量分別比相應(yīng)的對(duì)照組升高了243.4％、141.3％、410.5％和121.6％、505.5％、481.7％。
　　 3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)、法昵酸-

6、O-甲基轉(zhuǎn)移酶(farnesoie acid O-methyltransferase,FAMeT)和MF酯酶(MF esterase,MFE)在MF合成和降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用,相應(yīng)的基因表達(dá)各有特點(diǎn)。HMGR mRNA水平在大顎器官(MO)最高,其次是眼柄,肌肉和肝胰腺水平最低。KK-42處理可顯著抑制眼柄和MO中HMGR表達(dá),但二者下調(diào)模式不相同,前者mRNA水平在各時(shí)間點(diǎn)之間沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);而在MO下調(diào)幅度出現(xiàn)明顯波

7、動(dòng),其中在第1和7天,mRNA含量分別下降了82.5％和90.7％。FAMeT mRNA在眼柄、肌肉組織中的表達(dá)模式與MO明顯不同:前者組織中mRNA水平相對(duì)較低且變化較小,而在MO則出現(xiàn)明顯的波動(dòng),第2、6、7、8天FAMeT mRNA含量比第0天均增加1倍以上(P＜0.01)。KK-42處理后,上述三個(gè)組織中FAMeT表達(dá)均出現(xiàn)不同程度下調(diào),尤以MO最為顯著,其中第6天mRNA水平降低63.4％(P＜0.01)。KK-42處理能夠明

8、顯誘導(dǎo)肝胰腺M(fèi)FE轉(zhuǎn)錄,降低血淋巴MF滴度。
　　 首次從肝胰腺克隆出CYP4V18全基因序列,開(kāi)放閱讀框?yàn)?545bp,編碼515個(gè)氨基酸,其中包含CYP450保守序列。系統(tǒng)進(jìn)化顯示,CYP4V18與岸蟹CYP4C39和溝蝦CYP4C15蛋白同源性分別達(dá)到71.3％和59.5％。CYP4V18 mRNA水平在肝胰腺最高,分別是腦、Y-器官和肌肉組織的4、26和32倍。KK-42處理可顯著抑制CYP4V18表達(dá),第六天抑制率達(dá)到

9、187.7％(P＜0.01);血淋巴20E滴度逐漸升高。
　　 結(jié)論:在轉(zhuǎn)錄水平上,KK-42能誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺胰蛋白酶、血藍(lán)蛋白、組蛋白酶L、幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的表達(dá),對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用,上調(diào)肝胰腺HSP90和HSP70基因的表達(dá)。這可能增強(qiáng)了動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的利用,提高了動(dòng)物的耐受性,有利于動(dòng)物的快速生長(zhǎng)。再有,KK-42能分別降低和升高血淋巴MF、MH滴度,這是加快動(dòng)物異速生長(zhǎng)