副溶血弧菌毒力基因的表達(dá)變化研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，簡稱Vp)隸屬于弧菌科弧菌屬，是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及魚、貝類等海產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌。食用被副溶血弧菌污染的海產(chǎn)品可導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥甚至死亡。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已成為我國首要的食源性致病菌。
　　 目前研究認(rèn)為

2、副溶血弧菌最重要的致病因子是其產(chǎn)生的多種溶血毒素，主要有耐熱的直接溶血毒素(Thermostabledirecthemolyticus，TDH)，相對(duì)耐熱的直接溶血毒素(Tdh-relatedhemolysin，TRH)和不耐熱溶血毒素(Themolabilehemolysin，TLH)，它們分別由tdh，trh和tlh基因編碼，tlh(不耐熱溶血毒素)和tdh(耐熱直接溶血毒素)是副溶血弧菌主要的毒力基因。
　　 常用的副溶血

3、弧菌檢測方法包括傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法以及PCR等分子生物學(xué)方法，但這些方法在特異性、靈敏度、檢測周期、操作難易度以及檢測成本等方面各有缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timefluorescentquantitativePCR)技術(shù)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種通過檢測熒光信號(hào)的變化進(jìn)行核酸定量的技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程的技術(shù)。與常規(guī)PC

4、R相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。
　　 本研究將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于檢測副溶血弧菌兩種毒力基因tlh和tdh的表達(dá)變化上，建立了一種針對(duì)副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因(tlh)和耐熱的直接溶血毒素基因(tdh)毒力表達(dá)變化的檢測方法，通過比較毒力基因在不同應(yīng)激條件下表達(dá)量的變化可以間接比較菌株的毒力差異，進(jìn)而研究環(huán)境對(duì)副溶血弧菌致病力的影響。
　　 本文以在

5、不同條件下培養(yǎng)的三株Vp為材料，分別提取其總RNA，以16SrRArA內(nèi)標(biāo)基因，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測副溶血弧菌TLH和TDH基因在不同應(yīng)激條件下的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果表明：
　　 1、本研究比較了四種提取副溶血弧菌總RNA的方法，以PureLinkTMRNAMiniKit所得的總RNA質(zhì)量最佳，對(duì)PCR反應(yīng)的影響最小，其次是Trizol法，盡管總RNA濃度不及PureLinkTMRNAMiniKit，但純度跟Pu

6、reLink試劑盒不相上下，且PCR結(jié)果也較好。在所比較的四種方法中：PureLinkTMRNAMiniKit和Uniq-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒是市面常用的試劑盒，優(yōu)點(diǎn)是簡便快速，試劑簡單，對(duì)于標(biāo)本量大、靈敏度要求不高的PCR反應(yīng)則不失為簡單快捷的方法，但價(jià)格較貴。Trizol法和SDS法為傳統(tǒng)的經(jīng)典RNA純化方法，這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)是樣本裂解較充分，蛋白質(zhì)消化較完全；缺點(diǎn)是提取步驟較多，反應(yīng)時(shí)間較長，但所用試劑較普通試劑

7、盒便宜，所以更適合于廣大普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌總RNA的提取工作。
　　 2、本研究建立了一套檢測副溶血弧菌毒力基因表達(dá)差異的方法。16S是所有細(xì)菌都具有的基因片段，它在不同來源的副溶血弧菌中很保守，且該基因表達(dá)很穩(wěn)定。本研究選用16S基因片段作為比較副溶血弧菌tlh和tdh基因表達(dá)差異的內(nèi)標(biāo)。通過引入內(nèi)標(biāo)，就可以進(jìn)一步確定RNA量和反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA量的一致性。反轉(zhuǎn)錄PCR有一步反應(yīng)和兩步反應(yīng)法，本研究比較了這兩種方法，最終確定

8、兩步反應(yīng)法為使用方法，即將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR分兩步進(jìn)行，避免在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)由于初始提取的總RNA質(zhì)量欠佳所導(dǎo)致的后期實(shí)驗(yàn)失敗的情況，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程起到良好控制作用。
　　 3、通過運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行分析，得出以下結(jié)論：(1)影響tlh基因表達(dá)的因素之間的關(guān)系：菌株>鹽度>溫度；(2)影響tdh因表達(dá)的因素之間的關(guān)系：菌株>溫度>鹽度。綜合所有因素，進(jìn)一步比較，可以得出以下結(jié)論：鹽度對(duì)tlh的影響大于對(duì)tdh的

9、影響；溫度對(duì)tlh的影響小于對(duì)tdh的影響；菌株對(duì)tlh的影響大于對(duì)tdh的影響。
　　 4、本研究通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，得出：菌株的不同，即菌株內(nèi)部轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的不同對(duì)毒力基因的表達(dá)影響最大。其次是環(huán)境因素的影響，包括溫度、鹽度、酸堿度等。且不同的環(huán)境條件對(duì)不同毒力基因表達(dá)的影響程度不一致，在研究中，我們可以通過比較毒力基因表達(dá)量的大小來間接比較該致病菌的毒力大小。進(jìn)而通過改變環(huán)境條件來改變?cè)摼闹虏×?，從而為研究副溶血弧菌?/p>