副溶血弧菌tdh2基因敲除、表達及調(diào)控機制研究.pdf

1、副溶血弧菌是革蘭氏陰性嗜鹽菌，主要分布在近海岸的海水、海產(chǎn)品以及鹽漬食物中。它是一種食源性致病菌，生吃或者食用未煮熟的海產(chǎn)品會引起急性腸胃炎和敗血癥。TDH被認為是副溶血弧菌的重要致病因子，主要由tdh2基因編碼。由致病性副溶血弧菌感染引發(fā)的食物中毒已經(jīng)成為全球食品安全關(guān)注的一個重點。
　　本文應(yīng)用自殺載體 pDS132通過同源重組的方式對副溶血弧菌RIMD2210633進行tdh2基因的敲除，并對tdh2基因進行了回補試驗。從副

2、溶血弧菌的流行病學(xué)特性出發(fā)，比較分析了tdh2敲除株與親本株的生物學(xué)差異。并在此基礎(chǔ)上初步探討副溶血弧菌tdh2的表達和基因調(diào)控機制。
　　論文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.副溶血弧菌tdh2敲除株和回補株的構(gòu)建
　　通過重疊PCR技術(shù)將tdh2基因編碼區(qū)的上下游同源臂進行融合，克隆入自殺載體pDS132，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌S17λpir中。通過接合轉(zhuǎn)移的方法將重組質(zhì)粒pDS132轉(zhuǎn)移到副溶血弧菌RIMD221063

3、3中，經(jīng)第一輪及第二輪重組菌的篩選后獲得副溶血弧菌tdh2敲除株。為了驗證副溶血弧菌tdh2敲除株是否發(fā)生極性突變，本章對tdh2敲除株進行了tdh2基因的回補試驗。將tdh2基因片段克隆入載體pACYC184，通過電轉(zhuǎn)化的方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到副溶血弧菌tdh2敲除株中，從而得到副溶血弧菌tdh2回補株。本章成功獲得副溶血弧菌tdh2敲除株與回補株。
　　2.副溶血弧菌tdh2敲除株的生物學(xué)特性研究
　　致病性和非致病性副溶

4、血弧菌在逆環(huán)境中的生存能力不同。為了研究tdh2對副溶血弧菌在逆環(huán)境中的生存能力是否產(chǎn)生影響，本章通過比較副溶血弧菌親本株與tdh2敲除株在生長、蛋白表達、耐藥性、耐酸、耐膽汁等生物學(xué)特性方面的差異性，來分析tdh2基因?qū)Ω比苎【纳飳W(xué)特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在生長、耐藥性方面，兩者并沒有顯著性差異，而在蛋白表達、耐酸及耐膽汁方面兩者具有顯著性差異。tdh2敲除株與親本株的菌體蛋白表達在29 KD附近以及29 KD與44.3 KD之間存

5、在差異，其中一種差異性蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定可能為細菌素C ABC轉(zhuǎn)運ATP結(jié)合蛋白。副溶血弧菌親本株比Vp:△tdh2更能夠耐酸及耐膽汁。
　　3.副溶血弧菌TDH表達及調(diào)控機制研究
　　本章對tdh2基因進行了克隆，將tdh2基因片段連接到表達載體pGEX-4T-1上，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達了TDH。同時，本章采用熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)調(diào)控子mRNA的表達水平，以初步探討tdh2基因的調(diào)控機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與副溶血弧菌親本

6、株相比，tdh2敲除株中vp0301、vp1995、vp2553、vp1549、vpa1332、vpa1348、vp0527、vpa1361、vp2890、vpa1312和vpa313基因mRNA的表達水平具有顯著變化，結(jié)果表明tdh2基因能夠調(diào)控這11個基因，其中vp0301、vp1995、vp2553、vp1549、vpa1312和vpa313表達上調(diào)，vpa1332、vpa1348、vp0527、vpa1361和vp2890表達下