副溶血弧菌的基因分型研究.pdf

1、目的:探明深圳地區(qū)副溶血弧菌的主要流行血清型，了解自2006年以來副溶血弧菌菌株血清型之間的差異和其流行趨勢，為流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，建立副溶血弧菌的分子分型數(shù)據(jù)庫，為傳染來源的追蹤和爆發(fā)疫情的早期發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。本課題將從血清學(xué)分型、PFGE分型、MLVA分型方面對其進(jìn)行研究，從而逐步完善PFGE數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡(luò)，并建立MLVA方法體系，然后進(jìn)行應(yīng)用性評價，建立MLVA數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行相關(guān)聚類分析。
　　 方法:
　　

2、 (1)收集2006-2011年的副溶血弧菌菌株并血清型歸類，這些菌株均來自深圳市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗中心菌種保存庫。其主要從食品污染物監(jiān)測網(wǎng)和深圳市感染性腹瀉病原譜哨點(diǎn)監(jiān)測網(wǎng)中獲得;
　　 (2)篩選菌株，對其進(jìn)行純培養(yǎng)，采用細(xì)胞裂解，菌株包埋，酶切法對其進(jìn)行PFGE分型，采用脈沖場凝膠電泳成像系統(tǒng)分析，再用BioNumerics軟件進(jìn)行聚類分析;
　　 (3)純培養(yǎng)上一批菌株，用水煮法提取DNA，采用PCR方法

3、擴(kuò)增，并送出去測序，再用BioNumerics軟件進(jìn)行MLVA聚類分析，并結(jié)合PFGE分析結(jié)果作進(jìn)一步對比與探討。
　　 結(jié)果:
　　 (1)本實驗對包含2006-2011年的197株VP菌株全部進(jìn)行了血清型鑒定，共分離出31種不同的血清型，其中最主流的血清型為O3∶K6，所占比例為45.18％;其次為O4∶K8，對應(yīng)比例為10.15％; O1∶K25次之，對應(yīng)比例為7.11％，位居第三位;
　　 (2)99株臨

4、床與食品外環(huán)境來源的副溶血弧菌菌株經(jīng)脈沖場凝膠電泳后共得到90種不同的PFGE帶型，分型效率達(dá)到99.77％;98株食源性疾病暴發(fā)來源的副溶血弧菌經(jīng)脈沖場凝膠電泳后共得到26種不同的PFGE帶型，分型效率達(dá)到87.71％;
　　 (3)采用6個VNTR位點(diǎn)對深圳地區(qū)的99株臨床及食品外環(huán)境來源的副溶血弧菌進(jìn)行MLVA聚類分型。由結(jié)果可知，99株VP菌被大致分成96個MLVA型別和90個PFGE型別，其分辨系數(shù)分別為99.91％和

5、99.77％;采用6個VNTR位點(diǎn)對深圳地區(qū)的98株食源性疾病暴發(fā)來源的副溶血弧菌進(jìn)行MLVA聚類分析。由結(jié)果可知，98株VP菌被大致分成50個MLVA型別和26個PFGE型別，其分辨系數(shù)為97.14％和87.71％。結(jié)合9起確定暴發(fā)案例和2起疑似暴發(fā)案例結(jié)果，MLVA比PFGE有著更好的成簇率與聚集性，對暴發(fā)疫情的判斷更靈敏，識別能力更強(qiáng)，啟動流行病學(xué)調(diào)查更有說服力。
　　 結(jié)論:
　　 (1)深圳地區(qū)臨床來源的VP菌

6、株最主流血清型為O3∶K6，其次是O4∶K8，O3∶K29，O1∶K25等類型，食品外環(huán)境來源的VP菌株血清型多樣化，呈分散趨勢。
　　 (2) MLVA6個位點(diǎn)的聚類分析方法對分離自臨床、食品及外環(huán)境來源的VP菌株都能很好的分型，MLVA相對于PFGE，具有更高的分辨力，操作更為簡單，成本更低廉，結(jié)果更準(zhǔn)確。
　　 (3) MLVA6個位點(diǎn)，即TR2、TR4、TR5、TR8、TR9、TR10的聯(lián)合應(yīng)用適合于VP的分子分