貝類中副溶血弧菌的分子分型及風險評估研究.pdf

1、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolytics）廣泛分布于海水及海產(chǎn)品中，尤其是在海產(chǎn)貝類中。流行病學調(diào)查顯示該菌是引起我國沿海地區(qū)食物中毒的主要致病菌，人們通常由于食用了生的或者加熱不徹底的海產(chǎn)貝類而感染副溶血弧菌，并引起腸胃炎，中毒癥狀多為頭疼、腹瀉、嘔吐反胃、胃部痙攣和發(fā)低燒，少數(shù)情況下可引起敗血癥，進而導致死亡。近年來，在我國食用貝類而感染副溶血弧菌的事件時有發(fā)生，給人們身體健康帶來巨大威脅，也給貝類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失

2、。我國是貝類養(yǎng)殖大國，2009年海水貝類產(chǎn)量達1072萬噸，而東部沿海省份（山東、江蘇、浙江、福建）是我國貝類的主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量占全國貝類總產(chǎn)量的60％左右。因此調(diào)查我國東部沿海地區(qū)貝類中副溶血弧菌的分布情況，建立致病與非致病性副溶血弧菌的分型方法，開展貝類中副溶血弧菌的風險評估等研究，對保護消費者健康和保障我國貝類產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的意義。
　　本文優(yōu)化建立了貝類中副溶血弧菌的定量檢測方法;對東部沿海城市貝類中副溶血弧菌的分

3、布及特征狀況進行了調(diào)查;針對分離的菌株，系統(tǒng)運用現(xiàn)代分子生物學技術，建立了副溶血弧菌的分子分型方法;并在上述工作的基礎上，開展了貝類中副溶血弧菌的半定量和定量風險評估。具體研究結(jié)果如下:
　　1.副溶血弧菌檢測方法的建立與優(yōu)化
　　將常規(guī)微生物分離方法和PCR方法相結(jié)合，建立了副溶血弧菌的MPN-PCR檢測方法。本方法同國標方法（GB/T4789.7-2008）相近，首先采用TCBS對副溶血弧菌進行分離，但使用PCR方法對可

4、疑菌落進行鑒定，再結(jié)合MPN統(tǒng)計方法對樣品中的副溶血弧菌進行定量。與直接PCR相比，可以減少增菌液中雜菌影響，避免了因其它雜菌的存在而導致PCR假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，同時可得到純菌落，利于副溶血弧菌的后續(xù)研究。該方法同國標方法相比，檢測時間縮短了2～3天。
　　利用副溶血弧菌的雙重PCR檢測方法，結(jié)合酶聯(lián)免疫反應(ELISA)的方法，建立了副溶血弧菌的PCR-ELISA檢測方法。該方法利用雙鏈DNA互補結(jié)合的特點，設計了tlh和tdh

5、基因的特異性探針，并利用生物素對探針進行標記，探針同地高辛標記的PCR產(chǎn)物特異性結(jié)合后，經(jīng)顯色液顯色，可對樣品進行區(qū)分和定量。該方法提高了PCR檢測方法的特異性，可以對樣品進行定量分析，成本低廉，適合高通量的檢測分析。該方法在標準品的濃度高于104 copies/μL時，用肉眼可直接觀察到陽性結(jié)果，在標準品的濃度為102-106 copies/μL時，線性關系良好，可用于樣品的定量分析。
　　2.東部沿海城市貝類中副溶血弧菌的分布

6、及致病性研究
　　從2008年12月至2009年11月，采集了煙臺、威海、青島、連云港、舟山和廈門六個東部沿海城市的貝類樣品288個，其中牡蠣80個、菲律賓蛤仔72個、櫛孔扇貝70個、紫貽貝66個。調(diào)查結(jié)果顯示:有172個樣品檢出副溶血弧菌陽性，檢出率為59.72％，平均濃度為351.55 MPN/g。副溶血弧菌在貝類中的分布存在季節(jié)和地域差異，但四種貝類之間不存在差異。表明副溶血弧菌的分布主要受環(huán)境因素影響，且溫度的影響最大。<

7、br>　　分離的副溶血弧菌的血清分型結(jié)果顯示:172株菌中有155株可以區(qū)分其O群，其中O3群的菌株數(shù)最多，共有33株，占分離菌株總數(shù)的19.2％;僅有42株菌可區(qū)分其K型，存在大量K型無法區(qū)分的菌株。毒力檢測結(jié)果顯示172株菌中有2株攜帶tdh基因，5株攜帶trh基因。其中2株tdh陽性菌有溶血現(xiàn)象，5株trh陽性菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，表明2株tdh陽性菌具有致病性。
　　3.副溶血弧菌的分子分型方法研究
　　比較了RAPD和

8、ERIC-PCR兩種分型方法，結(jié)果顯示，RAPD可將供試的24株副溶血弧菌分為13個群，分辨力指數(shù)達0.931; ERIC-PCR可將24株副溶血弧菌分為10個群，分辨力指數(shù)達0.859。RAPD產(chǎn)生的帶型清晰，多態(tài)性高，RAPD分析方法操作簡便，耗時短，便于進行大規(guī)模的樣品分析，而且RAPD是在基因水平上對副溶血弧菌進行分型，其結(jié)果能反應副溶血弧菌的親緣關系及進化特征。RAPD方法同PFGE方法相比，需要DNA的量少，對儀器設備的要求

9、也較低，便于在不同層次的實驗室推廣，是一種有效的副溶血弧菌的分子分型方法，可應用于食品溯源以及流行病學調(diào)查等方面的研究。
　　利用建立的RAPD方法對172株菌進行了分型，結(jié)果顯示172株副溶血弧菌共有73種不同的帶型。聚類分析結(jié)果顯示在相似系數(shù)為0.85時，172株副溶血弧菌分別歸屬于18個RAPD類群，不存在無法區(qū)分的菌落。
　　本文分離得到了2株tdh陽性株，其血清型分別為O3∶K6和O4∶K68，經(jīng)RAPD分析顯示，

10、這2株菌和CDC提供的2個臨床分離株具有相似的帶型，歸屬于同一RAPD類群。表明O3∶K6及其相關血清型仍是副溶血弧菌的主要致病類型，同時也說明該RAPD方法能有效地將強致病性副溶血弧菌同其他菌株區(qū)分離開來。
　　利用AFLP技術對分離得到的8個O群的副溶血弧菌做了進一步分析。獲得了84個在不同O群中差異的片段，四種引物組合E-T/M-T，E-C/M-C，E-C/M-G和E-G/M-C產(chǎn)生的差異的片段數(shù)量最多。根據(jù)有差異的片段設計

11、引物，篩選得到了8個SCAR標記，可以區(qū)分不同的O群。
　　4.副溶血弧菌的半定量風險評估研究
　　本文利用Risk Ranger軟件對魚類、蝦類和貝類中的副溶血弧菌做了半定量風險評估，結(jié)果顯示貝類中副溶血弧菌的風險明顯高于其它兩種產(chǎn)品，在資源有限的情況下，可以優(yōu)先進行貝類中副溶血弧菌的定量風險評估。
　　通過評估發(fā)現(xiàn):如果在貝類銷售前采取適當?shù)目刂剖侄危山档透腥靖比苎【娘L險;另一重要措施就是食用前的準備過程。在

12、其它條件不變的情況下，僅在“食用前徹底加熱”就可完全消除，風險值就為0，因此，食用前的準備非常重要，建議消費者在食用貝類前將其充分加熱。
　　5.貝類中副溶血弧菌的定量風險評估
　　收集了貝類中副溶血弧菌定量數(shù)據(jù)839個，結(jié)合CAC的食品安全風險分析理論和基于蒙特卡羅技術的@Risk定量風險評估軟件開展了貝類中副溶血弧菌的定量風險評估研究。暴露評估的結(jié)果顯示:六個城市的居民在不同季節(jié)因食用貝類攝入的致病性副溶血弧菌的數(shù)量存在

13、差別，夏季和秋季的暴露量明顯高于春季和冬季，六個城市的居民在春季、夏季、秋季和冬季的每餐暴露量的平均值分別為13.37個、62.40個、59.98個和12.9個副溶血弧菌;不同城市之間的暴露量也存在差異，舟山和廈門的暴露量明顯高于其他城市，其中最高的暴露量出現(xiàn)在夏季的舟山，平均暴露量為83.07個，最低的則為冬季的青島，平均暴露量為6.66個。敏感性分析結(jié)果顯示:各個變量因素對暴露量的影響各不相同，對暴露量影響最大的是貝類中副溶血弧菌含

14、量，其次為每餐消費量和城市的氣溫，貯藏時間的影響最小，其中氣溫對居民暴露量的斯皮爾曼等級相關系數(shù)在夏季為0.22，秋季為0.18，春季為0.10，冬季則為-01.0，表明氣溫對暴露量的影響在春、夏、秋季為正相關，冬季則為負相關。
　　風險評估的結(jié)果顯示，夏季和秋季六個城市居民因食用貝類引發(fā)腸胃炎的概率明顯高于春季和冬季，春季、夏季、秋季和冬季發(fā)病概率的平均值分別為6.19×10-6、3.76×10-5、2.58×10-5和5.49