副溶血弧菌的分子檢測與基因分型研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytcus)是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌,廣泛分布于海洋等鹽濃度相對較高的環(huán)境中,各種海產(chǎn)品及水產(chǎn)品是其感染的主要對象,人們在誤食了副溶血弧菌感染的食物后,會引起急性腸胃炎,出現(xiàn)腹瀉,嘔吐,腹部痙攣等癥狀甚至死亡。在世界范圍內(nèi),包括中國、日本在內(nèi)的很多亞洲國家,歐洲以及美國,經(jīng)常發(fā)生由于食用了副溶血弧菌感染的海鮮之后引起的食物中毒事件,因此副溶血弧菌被認為是在世界范圍內(nèi)食用海產(chǎn)品引起的人類腸胃

2、疾病的主要病因。 研究認為直接耐熱溶血素(TDH)和相對耐熱溶血素(TRH)是副溶血弧菌最重要的兩個致病因子,分別由tdh和trh基因編碼,并能夠作為區(qū)分致病性與非致病性副溶血弧菌的標志。從環(huán)境或海產(chǎn)品中分離得到的副溶血弧菌多為非致病性,而臨床分離的副溶血弧菌90％以上能夠分泌TDH,具有致病性。目前對副溶血弧菌的研究主要涉及副溶血弧菌的生理生化分離鑒定、分子手段的快速檢測、不同來源以及不同表型副溶血弧菌的分子多態(tài)性分析、毒力蛋

3、白的表達與結(jié)構(gòu)分析等方面。我國有3.2萬公里的海岸線,海產(chǎn)品在我國東南沿海地區(qū)十分盛行,特別是江浙一帶地區(qū)海產(chǎn)品以其味美而深受消費者的喜愛,但是由副溶血弧菌而引起的海產(chǎn)品中毒的報道也屢見不鮮。 因此對副溶血弧菌的快速、準確地檢測對預防該菌在食物源中的污染具有重要意義,本實驗旨在對2006年浙江地區(qū)不同來源的副溶血弧菌攜帶毒力基因的特征進行分析,并利用RAPD技術對這些副溶血弧菌進行基因分型的研究,從而為建立副溶血弧菌的基因指紋圖

4、譜奠定一定的基礎,同時又發(fā)展了快速檢測副溶血弧菌的新方法,為副溶血弧菌感染的監(jiān)控和防治提供技術平臺。 1、用PCR法對2006年浙江省臨床和海產(chǎn)品中分離得到的副溶血弧菌進行毒力基因tdh和trh的檢測。結(jié)果表明,臨床病人中分離到的副溶血弧菌中tdh基因的攜帶率為92.31％,trh基因的攜帶率為1.54％,91.54％為tdh陽性、trh陰性菌；海產(chǎn)品中分離得到的副溶血弧菌tdh基因的攜帶率為1.11％,trh基因的攜帶率為2.

5、22％,96.67％是tdh陰性、trh陰性菌,說明引起浙江地區(qū)食物中毒的副溶血弧菌主要是tdh陽性菌,而攜帶trh基因的副溶血弧菌可能是一個潛在的致病原。 2、利用RAPD技術對所有臨床分離的副溶血弧菌和部分海產(chǎn)品中分離的副溶血弧菌進行基因分型。通過RAPD條件的優(yōu)化,篩選到四條能夠獲得清晰DNA擴增條帶的隨機引物,在175個副溶血弧菌中共產(chǎn)生53個RAPD位點,其中多態(tài)性位點45個。聚類分析顯示,四個不同來源的副溶血弧菌具有

6、較高相似性系數(shù),其中杭州中醫(yī)院和邵逸夫醫(yī)院聚為一類,再和紹興人民醫(yī)院聚為一類,最后再和海產(chǎn)品聚為一類。個體分析的結(jié)果表明,臨床分離的副溶血弧菌多聚為一類,遺傳相似性較高,而海產(chǎn)品分離的副溶血弧菌多態(tài)性更為豐富,175個副溶血弧菌被分為43個組,其中A組包括了74.6％的臨床菌株,Ⅰ組包括了52.1％的海產(chǎn)品分菌株,而40％的海產(chǎn)品分離株各自獨立為一組。91.1％血清型為O3的副溶血弧菌屬于A組,并且該組所有的菌株都為tdh陽性,trh陰

7、性菌,進一步說明引起食物中毒的副溶血弧菌主要是tdh陽性菌,并且表明血清型為O3的副溶血弧菌更容易引起感染。 3、為了發(fā)展快速、準確的副溶血弧菌分子鑒定技術,以RAPD實驗結(jié)果為基礎,設計了新的檢測引物,研究了快速檢測副溶血弧菌的PCR技術和基于SYBR Green I為熒光染料的定量PCR技術。該類方法對副溶血弧菌均具有很好的特異性,其它弧菌和非弧菌類微生物都沒有產(chǎn)生特異性擴增條帶,其中PCR檢測的最低檢出限為5 pg;熒光定