副溶血弧菌及其相關(guān)毒力因子檢測(cè)方法的建立.pdf

1、弧菌(Vibrio)是自然物種多樣化的細(xì)菌，主要棲息于水體和水生動(dòng)物中。分離到的弧菌中有70％以上是霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌，這些弧菌不僅對(duì)動(dòng)物有致病性，還對(duì)人類健康有很大的威脅。被霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌感染的主要原因是吃了被污染的海產(chǎn)品和傷口暴露于水環(huán)境。其中副溶血弧菌是引起食源性細(xì)菌胃腸炎的最主要原因，主要的毒力因子是耐熱直接溶血素(TDH)和耐熱相關(guān)溶血素（TRH）。
　　根據(jù)霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌gr

2、oEL基因序列設(shè)計(jì)三對(duì)引物分別為groVc、groVp和groVv，建立同時(shí)檢測(cè)三種弧菌多重PCR方法，經(jīng)過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)體系為(25μL):PCR Mix10μL，上下游引物(10pmM)各0.5μL，模板2μL，用ddH2O調(diào)整終體積至25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s;退火溫度66℃，退火時(shí)間30s;72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。檢測(cè)結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有較高的特異

3、性，對(duì)目標(biāo)菌株DNA的檢測(cè)靈敏度分別為霍亂弧菌1ng/μL，副溶血弧菌1ng/μL，創(chuàng)傷弧菌1ng/μL。該方法能同時(shí)檢測(cè)到三種弧菌，為開展霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌感染的調(diào)查提供了技術(shù)手段。
　　以副溶血弧菌的toxR基因、耐熱直接溶血素(TDH)基因和耐熱相關(guān)溶血素(TRH)基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)三對(duì)引物，建立檢測(cè)副溶血弧菌主要毒力因子的多重PCR檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)體系為(25μL): PCR Mix1

4、0μL，上下游引物（10pmM）量為trh各2μL，tdh各0.5μL; toxR各0.5μL，模板2μL，用ddH2O調(diào)整終體積至25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min;94℃變性，45s;退火溫度60℃，退火時(shí)間45s;72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。toxR、trh、tdh三對(duì)引物檢測(cè)到的副溶血弧菌的最低濃度分別是1×10-2 ng/μL，0.1ng/μL，0.1ng/μL。特異性的檢測(cè)及人工布菌試驗(yàn)

5、，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的引物具有較強(qiáng)的特異性。本方法可以作為一種快速檢測(cè)致病性副溶血弧菌的方法。
　　本試驗(yàn)以直接耐熱溶血素(TDH)為抗原建立了檢測(cè)副溶血弧菌的Dot-ELISA方法，血清抗體由本實(shí)驗(yàn)室研制，通過(guò)多次優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件為加樣的PVDF膜在20％的脫脂乳中封閉1h，與1∶100的血清抗體反應(yīng)30min，與1∶1000的HRP-羊抗兔IgG反應(yīng)1h，血清稀釋液和洗滌液均為PBST。通過(guò)特異性及靈敏度的檢測(cè)，表明該方法操作