副溶血性弧菌及其毒力相關因子誘導細胞毒性的分子與細胞機理研究.pdf

1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種食源性致病菌，廣泛分布于貝類及各種海產品中。Vp致病性菌株會引起傷口感染、敗血癥，或急性胃腸炎等疾病，出現腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心和腹部絞痛等，通常直接生食或半生食海產品，或者食用經Vp交叉感染的其他食品均會引發(fā)Vp食物中毒，可使免疫功能不全的人群引起嚴重的疾病，甚至死亡。Vp致病性菌株是引起亞洲國家，包括日本、中國等，食源性疾病的主要原因之一，也是在美國發(fā)生的海產

2、品引起胃腸炎的主要原因。自2001以來，由于食用海產品引起的弧菌感染發(fā)病率持續(xù)增長，嚴重威脅公共健康。近年來，弧菌疾病爆發(fā)造成的水污染嚴重影響了個人、經濟、社會以及公共健康衛(wèi)生。O3∶K6血清型作為Vp流行性菌株最主要的血清型，可產生耐熱性直接溶血素(TDH)或耐熱性相關溶血素(TRH)。Vp具有兩套Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SSs(Ⅰ，Ⅱ)，可分泌效應蛋白到宿主細胞質，引起細胞毒性和腸毒性。研究表明Vp大流行株中存在毒力島(VpaIs)，可引起

3、人和動物的腸道積水、水性腹瀉等疾病。盡管目前Vp引起腹瀉的具體機制尚不清楚，但腸道疾病與毒力特性（如黏附性）和其他毒力因子（如胞外酶、毒素TDH/TRH）有關。這些毒力因子為細胞毒素和腸毒素，已被多種細胞模型和動物模型證實，然而，毒力因子是否具有宿主特異性仍不清楚。而且，Vp流行菌株的原宿主鮮有報道，其主要原因是與其它食源性疾病相比，對致病性的不完全理解，包括環(huán)境、海產品分離株與臨床分離株的聯系。VP感染與社會經濟狀態(tài)、氣象改變、供水質

4、量以及公共環(huán)境衛(wèi)生并沒有相關性。比較研究流行菌株和非流行菌株的差異性，雖可顯示流行菌株的演變，但目前尚不能明確地闡明其出現的原因。本研究利用非吞噬細胞系建立了體外細胞感染模型，比較了副溶血性弧菌臨床分離菌株與環(huán)境菌株誘導的細胞毒性效應及其評價指標。在此基礎上，對Vp基因組中的部分推測的與致病性相關的基因進行了敲除，研究其對細胞毒性和腸毒性的影響及其可能的作用機制，并應用幼兔感染模型進行結果驗證。通過體外免疫試驗對副溶血性弧菌的先天性免疫

5、特性進行了研究，研究結果為Vp菌株的毒力評價及致病性分子機制的理解提供了新的方法與依據。
　　我們對5株副溶血性弧菌菌株的毒力基因tdh、trh、tlh和orf8以及生長特征進行研究，結果顯示分離株Vp024、Vp038和大流行株RIMD2210633（血清型O3∶K6）具有相同的基因型，均為tlh+tdh+trh-orf8+，分離株Vp005基因型為tlh+tdh+trh-orf8-，分離株Vp029 tlh+tdh-trh-o

6、rf8-，菌株Vp038在37℃有氧培養(yǎng)條件下顯示了較高的最大群體密度，其它菌株具有相似的生長特性，所有菌株在0-2h內增殖倍數沒有顯著差異(p＞0.05)。應用非吞噬細胞系Caco-2建立體外感染模型測定了5株分離株的細胞毒性，結果發(fā)現:細胞在感染后的不同階段和不同菌株之間差異程度不同，其中感染60min，不同菌株的黏附指數和侵襲指數均具有顯著差異，分離株Vp024和Vp005黏附指數顯著高于其它菌株(p＜0.05);Vp024的侵襲

7、指數顯著高于對照菌株和其它分離株(p＜0.01)，但感染180min后菌株間差異性不顯著。對模型細胞的胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、pH、鈣離子(Ca2+)以及線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平測定結果顯示:Caco-2細胞感染副溶血性弧菌后，胞內Ca2+水平明顯增加，NO水平顯著下降，但不同菌株

8、之間沒有顯著差異;但胞內ROS、pH和MMP水平變化具有菌株依賴性。對細胞誘導凋亡結果顯示，分離株Vp024、Vp005和Vp029共培養(yǎng)3h誘導凋亡率顯著高于大流行株RIMD2210633。我們的研究結果表明所有副溶血性弧菌（包括大流行株和環(huán)境株）均能黏附和侵入非吞噬性上皮細胞，并且能夠通過調節(jié)胞內ROS在胞內存活和復制，最終導致細胞損傷，這種副溶血性弧菌誘導的細胞損傷并不依賴于經典的細胞凋亡機制。
　　在此基礎上我們通過構建R

9、IMD2210633基因缺失株以及體外細胞模型進一步研究了宿主細胞對毒力相關基因VPA1656、VP2118和VPA1321的反應，及其可能的致病性分子機制。弧菌鐵調節(jié)受體蛋白編碼基因VPA1656在正常情況對副溶血性弧菌細胞毒性和腸毒性沒有影響。鐵調節(jié)受體蛋白編碼基因VPA1656與該菌在體內鐵離子攝取有關，在鐵限制的條件下，通過利用胞內鐵元素作為鐵離子來源，造成細胞損傷。我們構建了RIMD2210633基因缺失株(RIMDΔ VPA

10、1656)并比較研究了VPA1656基因缺失株和野生型菌株的細胞毒性和腸毒性。結果表明突變株也能夠黏附和侵入體外培養(yǎng)的細胞，感染細胞的ROS、NO和胞內pH參數下降水平顯著高于未感染細胞，Ca+2和MMP水平顯著高于對照細胞。而突變株誘導的LDH釋放和細胞死亡率和親本株沒有顯著區(qū)別。此外在幼兔體內感染模型中，細菌的定植、存活以及腸液積水率均與親本株沒有顯著區(qū)別，組織病理學觀察顯示突變株和親本株均能夠引起感染動物大部分腸道的壞死。

11、　　在Vp基因組中有三個基因與Vp的抗氧化性脅迫有關，其中VP2118是抗氧化脅迫的主要基因，但是VP2118與其在胞內的存活和致病性的關系尚不清楚。我們發(fā)現腸道細胞中的活性氧水平對副溶血性弧菌的胞內存活具有重要作用。為了理解VP2118基因對副溶血性弧菌的胞內存活和致病性的作用。我們構建了VP2118基因敲除菌株(RIMDΔVP2118)并研究了突變株在體外Caco-2細胞模型和幼兔模型中的毒性。結果顯示RIMDΔVP2118的SOD

12、活性顯著降低，并且通過基因互補可以回復突變。與野生菌株相比，RIMDΔ VP2118黏附和侵襲指數以及對ROS的抵抗力顯著降低，通過VP2118基因互補可恢復感染能力。RIMDΔVP2118對非吞噬細胞的細胞毒性效應顯著下降，誘導LDH、細胞凋亡以及細胞死亡率顯著降低于親本株;而且，細菌在體內的生長和存活率相對于親本株有所下降;突變株誘導幼兔腸液積水率顯著降低，組織病理觀察顯示:感染野生菌株的幼兔腸道細胞壞死，而感染RIMDΔVP211

13、8的幼兔大部分腸道內壁僅出現局部輕微的細胞壞死。RIMDΔVP2118感染人非吞噬細胞，可刺激產生促炎因子和抗炎細胞因子的分泌，與親本株相比，突變株誘導的細胞因子釋放顯著減弱（p＜0.01）。通過對比分析我們還發(fā)現體外的細胞毒性參數與幼兔模型中的腸毒性參數（體內細菌存活率和腸液累積率）呈正相關。結果表明FeSOD基因(VP2118)主要通過提高副溶血性弧菌對非吞噬性腸上皮細胞產生的ROS抗性，在動物模型中提高了Vp在腸道中的存活率，進一

14、步提高了對宿主組織感染能力。
　　VPA1321編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白，與Yersinia spp.和致病性大腸桿菌的細胞毒素高度同源，被認為是主要的細胞毒性相關因子，但是我們的研究結果表明VPA1321對Vp在體外細胞感染模型中的毒力并沒有起主導作用。VPA1321基因敲除菌株(RIMD△VPA1321)與親本株具有顯著差異性，突變株的細胞侵襲能力顯著下降;但仍然具有黏附細胞單層的能力。此外突變株在調節(jié)體外細胞模型參數(ROS

15、，NO，pH，Ca+2，和MMP)以及誘導細胞釋放LDH等方面和親本株沒有顯著差異，親本株和突變株均能夠導致完整細胞的破壞。
　　本論文利用FACS研究了Vp臨床分離株對非吞噬細胞的細胞毒性效應。腸道致病菌獲得逃避宿主的先天性反應的適應性有助于其致病能力，并且防止其被快速消除，Vp的致病性是基于其黏附和入侵，我們通過感染細胞中ROS的變化證實增大Vp的ROS抵抗能力可促進Vp在腸道中的存活，抑制宿主的氧化應激反應，促進組織感染。幼