基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析副溶血性弧菌對(duì)超高壓的耐受機(jī)理.pdf

1、本文通過對(duì)水產(chǎn)品致病菌——副溶血性弧菌（VibrioParahaemolyticus）的致病株C4株系進(jìn)行多輪超高壓篩選，得到相應(yīng)的耐壓菌株N11。接著以C4和N11菌株為研究對(duì)象，分析了超高壓處理對(duì)這2株細(xì)菌的細(xì)胞壁膜影響、細(xì)胞損傷情況、以及耐壓菌株的耐壓機(jī)理。進(jìn)而利用Seq-RNA測(cè)序技術(shù)分析超高壓脅迫下這2株菌內(nèi)的差異表達(dá)基因，結(jié)合基因組數(shù)據(jù)篩選出的耐壓菌株N11中的突變堿基位點(diǎn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)考察了差異表達(dá)基因和突變

2、位點(diǎn)調(diào)控的基因在超高壓脅迫下的表達(dá)規(guī)律，從分子水平探討了副溶血性弧菌對(duì)超高壓的耐受機(jī)理。具體結(jié)論如下:
　　(1)研究了副溶血性弧菌原始菌株C4株和耐壓菌株N11株對(duì)超高壓的耐受性，在200 MPa以上(含200 MPa)壓力處理時(shí)，C4株全部死亡，N11株有少量細(xì)菌存活。
　　(2)分析超高壓處理對(duì)C4和N11菌株細(xì)胞膜通透性、Na+/K+-ATP酶活、表面zeta電位、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)CAT酶活性的影響。結(jié)果表明超高壓

3、可破壞細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞膜通透性增加、酶活性降低、細(xì)胞內(nèi)容物泄漏、細(xì)胞擬核凝聚和低電子區(qū)等現(xiàn)象;在相同壓力的超高壓脅迫下，C4株細(xì)胞壁膜的破壞程度較耐壓菌株高，超高壓殺菌的主要原因可能是通過損傷細(xì)胞壁膜發(fā)揮作用;N11株中的過氧化氫酶對(duì)超高壓有更高的抗逆性，進(jìn)而提高了菌株對(duì)超高壓的耐受性。
　　(3)采用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)分析了C4和N11菌株在超高壓脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，從中篩選出一系列的差異表達(dá)基因。進(jìn)而對(duì)這些差異表

4、達(dá)基因進(jìn)行COG和WEGO功能分析，發(fā)現(xiàn)在壓力脅迫條件下，野生型菌株C4內(nèi)與細(xì)胞膜結(jié)合蛋白、代謝及生物調(diào)控過程等相關(guān)的基因表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，同時(shí)，與無機(jī)鹽離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、抗氧化作用、細(xì)胞殺傷作用相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了下調(diào)，這可能是導(dǎo)致副溶血性弧菌的細(xì)胞膜遭到破壞，繼而誘發(fā)細(xì)菌死亡的重要原因;而耐壓菌株在壓力脅迫時(shí)，與細(xì)胞活力、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生物過程調(diào)控相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯發(fā)生提高、此外還有含CBS結(jié)構(gòu)域膜蛋白、ABC型磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、5

5、0S核糖體蛋白、周質(zhì)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了上調(diào)，這都有助于耐壓菌株N11對(duì)超高壓脅迫的耐受能力。
　　(4)對(duì)上述差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超高壓處理后，與野生型C4株相比，耐壓菌株N11對(duì)碳源和氨基酸的利用能力有所降低，且能量合成量減少。
　　(5)對(duì)野生型C4和耐壓菌株N11之間進(jìn)行全基因組的比較分析，從N11株中預(yù)測(cè)出編碼區(qū)內(nèi)有8個(gè)基因共16個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生了突變，非編碼區(qū)內(nèi)有22個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生了突

6、變。進(jìn)而，在這些突變位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序，最終鑒定出18個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生了突變，它們均位于非編碼區(qū)，推測(cè)這些突變的堿基位點(diǎn)可能通過影響上下游基因的表達(dá)水平，從而來增強(qiáng)細(xì)胞的耐受超高壓能力。
　　(6)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR考察突變位點(diǎn)上下游基因在野生型C4和耐壓菌株N11之間的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)C4_4362基因在C4株中表達(dá)量顯著下調(diào)可提高其對(duì)壓力敏感性;C4_4609基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致菌株死亡