副溶血性弧菌toxR-S PCR檢測(cè)方法的建立和華東地區(qū)分子流行特征分析.pdf

1、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp），是弧菌科（Vibrio）弧菌屬的桿菌或多形態(tài)的革蘭氏陰性菌，具嗜鹽性，廣泛存在于海洋以及河口環(huán)境，通過(guò)食品傳播，是遍布世界的食源性致病菌，人多因食用被本菌污染的生的或未煮熟的海鮮而引起急性胃腸炎發(fā)生食物中毒。我國(guó)每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的報(bào)道，且在食源性致病引發(fā)的食物中毒病例中占首要位置，快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查有助于該病的控制。
　　傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在操作

2、繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高等問(wèn)題，促使以檢測(cè)特異靶基因?yàn)槟繕?biāo)的分子檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展。目前PCR檢測(cè)方法大多基于毒力基因或看家基因，存在假陽(yáng)性和漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，建立敏感而特異的快速分子檢測(cè)方法迫在眉睫。本文在對(duì)toxRS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及同源性分析的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)toxR、toxS均有作為種特異性檢測(cè)靶基因的可能，故分別設(shè)計(jì)引物primers-R、primers-S及primers-R-S，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件建立相應(yīng)PCR方法，通過(guò)對(duì)57株副溶血

3、性弧菌和19株親緣相近菌及食源性致病菌的檢測(cè)，toxR-SPCR顯示出較好的穩(wěn)定性和特異性，檢測(cè)極限達(dá)2pg基因組DNA。toxR-SPCR方法進(jìn)一步與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比驗(yàn)證，通過(guò)對(duì)359份市場(chǎng)海產(chǎn)品檢測(cè)，符合率高達(dá)95.82％，敏感性100％，特異性92.39％。對(duì)兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性差異的15份樣品，以其總細(xì)菌DNA為模板擴(kuò)增副溶血性弧菌看家基因，測(cè)序比對(duì)顯示與副溶血性弧菌同源性高達(dá)97％以上。表明所建立的方法具有快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，可廣

4、泛用于副溶血弧菌的快速檢測(cè)。
　　現(xiàn)已有對(duì)江蘇周邊、舟山、上海等地區(qū)副溶血性弧菌分子流行病學(xué)的報(bào)道，但缺乏對(duì)華東區(qū)域整體的調(diào)查分析，而華東地區(qū)4省1市臨海，是副溶血性弧菌污染的“重災(zāi)區(qū)”，加強(qiáng)對(duì)該區(qū)域毒力相關(guān)基因的分子流行病學(xué)方面的調(diào)查分析，對(duì)防控副溶血性弧菌的大流行性爆發(fā)有重要意義。本文對(duì)華東地區(qū)分離到的Vp進(jìn)行大流行相關(guān)毒力基因的檢測(cè)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)。152株分離株共檢出4株致病株（tdh+或trh+），其中2株為

5、可能形成大流行的菌株（tdh+和toxRS/new+）。MTase檢出率為1.3％，所有分離株不攜帶完整的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，78.3％的分離株攜帶全套的Ⅵ型分泌系統(tǒng)。152株Vp分為84個(gè)STs，其中新的STs有69個(gè)。聚類分析表明一部分環(huán)境分離株與臨床致病株看家基因進(jìn)化關(guān)系相近，同種類宿主分離株的STs更有可能生成聚類關(guān)系，此外，歸屬于同源復(fù)合體CC3并非致病株的必要條件。以系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)，對(duì)毒力基因分布圖及宿主來(lái)源進(jìn)行歸類，發(fā)現(xiàn)環(huán)境