副溶血弧菌噬菌體固定化制劑的制備及其應用.pdf

1、本文對副溶血弧菌噬菌體(Vibrio parahaemolyticus phage)進行了固定化，制備出用于改善水體環(huán)境的噬菌體小球以及用于養(yǎng)殖動物口服的噬菌體微膠囊，為噬菌體固定化制劑的研制及應用奠定了基礎。具體研究結果如下：1.采用復相乳液法，以乙基纖維素為包囊材料，明膠溶液為保護液制取微膠囊。檢驗了乙基纖維素溶液的濃度、攪拌速度、芯材：壁材的體積比以及保護液濃度對微膠囊制備的影響。通過單因素實驗和正交實驗，可以得到在實驗條件下：攪

2、拌速度均為600r/min，時間30min，芯材：壁材為1:3，壁材濃度為3％，明膠濃度為2％時得到的微膠囊綜合評價最好。2.對噬菌體的吸附固定化實驗結果如下：比較了4種吸附劑：滑石粉+硅藻土(3:1)，活性炭，蒙脫石，玻璃纖維對副溶血弧菌噬菌體的吸附效果。其中，蒙脫石和玻璃纖維對噬菌體的吸附效果稍好，但由于吸附同樣多的噬菌體，需要玻璃纖維的量(3g)遠遠大于蒙脫石(0.5g)的量，因而選擇蒙脫石作為噬菌體的吸附劑?？紤]了吸附劑的量、吸

3、附時間及吸附液的PH對噬菌體固定化的影響。通過單因素實驗和正交實驗，可以得到在實驗條件下：蒙脫石的量為0.5g，吸附時間為1h，吸附液的PH為6時，吸附效果最佳。3.保護劑海藻糖的制取及對噬菌體的保護作用實驗結果如下：采用黑曲霉和酵母兩步發(fā)酵木薯。測得黑曲霉在木薯培養(yǎng)液中在77—84h這段時間，發(fā)酵液中的還原糖的量達到最大，而在84h之前發(fā)酵液中總糖的量變化不大，之后隨著進一步發(fā)酵，總糖的量逐漸減小。因而選在黑曲霉發(fā)酵木薯培養(yǎng)液80h左

4、右時加入酵母。在相同條件的情況下，經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后的木薯培養(yǎng)液中所培養(yǎng)酵母菌數(shù)明顯多于未發(fā)酵的木薯培養(yǎng)液，且不將黑曲霉離心直接加入酵母發(fā)酵的效果好于離心后再加入酵母發(fā)酵的效果。另外，隨著發(fā)酵的進行氨基酸的量都有了顯著的增加。800mL的酵母培養(yǎng)液經(jīng)離心后得到39.013g的酵母，煮沸提取后，經(jīng)過堿金屬(重金屬)除蛋白、活性炭脫色、陰陽離子交換、膜過濾、濃縮、結晶、過濾及干燥即得到成品，采用紙層析初步鑒定為海藻糖，經(jīng)葸酮-硫酸法測得海藻糖的

5、量為705.09mg，可知，從酵母中提取海藻糖的得率為1.807mg/g(濕重)。由海藻糖對副溶血弧菌噬菌體的保護作用實驗可知，在常溫條件下，海藻糖對副溶血弧菌噬菌體的保護作用不明顯，有、無海藻糖保護的噬菌體的效價相差不大，都在106pfu/mL，當溫度超過60℃時，對噬菌體的保護作用較為明顯，有海藻糖保護的噬菌體的效價(1.6×106pfu/mL)比無海藻糖保護的噬菌體的效價(2.4×105pfu/mL)高了一個數(shù)量級。 由5

6、0℃水浴中作用不同時間的實驗可知，作用10h以后，無海藻糖保護的噬菌體的效價(108)小于有海藻糖保護的噬菌體效價(109)一個數(shù)量級，說明海藻糖對副溶血弧菌噬菌體有較有效的保護作用。而在4℃時，無海藻糖保護的噬菌體效價從1.2×108pfu/mL降為2.5×107pfu/mL，下降了一個數(shù)量級，而有海藻糖保護的噬菌體的效價從2.6×109pfu/mL降為5.8×108pfu/mL，也下降了一個數(shù)量級，但較無海藻糖保護的噬菌體下降的幅度

7、要小，酵母水提液中的噬菌體效價從7.3×108pfu/mL降為1.6×108pfu/mL，在同一數(shù)量級上，說明在4℃時海藻糖對副溶血弧菌噬菌體略有保護作用，其低溫保護作用不如高溫保護作用明顯。4.以聚乙烯醇和海藻酸鈉為載體材料對噬菌體進行包埋固定化得到大小為2—3mm左右的固定化小球。以此方法制得了三種小球：只加噬菌體的固定化小球I、蒙脫石先對噬菌體進行吸附固定再進行包埋固定的噬菌體小球II以及先在噬菌體中添加保護劑海藻糖，再蒙脫石吸附

8、固定，然后包埋固定的噬菌體小球III。將這三種小球分別投入200mL滅菌的海水中作用15d后，比較三種固定化小球在水體中的作用情況可知，噬菌體小球I和II在水體中的噬菌體的量開始時是隨著小球中噬菌體的不斷釋放而增大，但增大到7d后，其量開始減小，(噬菌體小球I從開始的3.5×105pfu/mL增大到4.2×106pfu/mL，7d后開始下降，15d時降到2.6×106pfu/mL，噬菌體小球II從開始的6.2×104pfu/mL增大到2

9、.9×106pfu/mL，7d后開始下降，15d時降到2.3×106pfu/mL)，而有海藻糖保護的噬菌體小球的水體中噬菌體的量仍然是不斷增大(從1.7×106pfu/mL增大到2.5×106pfu/mL)，說明噬菌體小球III中噬菌體的活性好于小球I和II。15d后，噬菌體小球II和III中噬菌體的量(分別為0.4×108pfu/mL和0.8×108pfu/mL)多于噬菌體小球I中的量(9.0×106pfu/mL)，說明噬菌體小球II