副溶血弧菌噬菌體VPp1內(nèi)溶素基因預(yù)測表達(dá)及其抑菌活性初步研究.pdf

1、副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性菌，可導(dǎo)致人畜共患病，廣泛的存在于海洋環(huán)境及各種海產(chǎn)品中，包括海水沉積物、魚、蝦、貝類等。副溶血弧菌被認(rèn)為是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的條件致病菌，并且容易引發(fā)人類大規(guī)模食物中毒，為了防控副溶血弧菌的危害，抗生素的大量使用導(dǎo)致弧菌耐藥性增強(qiáng)，新型抗菌素的需求已經(jīng)迫在眉睫。噬菌體及其編碼的內(nèi)溶素是細(xì)菌的自然天敵，可以專一、快速、高效的裂解細(xì)菌，內(nèi)溶素又被稱為21世紀(jì)最有前景的酶類抗生素之一。
　　本研究以副溶血弧菌噬菌體

2、為研究對象，通過對實(shí)驗(yàn)室保存的多株副溶血弧菌噬菌體進(jìn)行初步篩選，從中篩選出一株優(yōu)勢噬菌體VPp1，通過對噬菌體VPp1功能基因組學(xué)分析，從生物信息學(xué)的角度詮釋噬菌體VPp1對副溶血弧菌的裂解機(jī)制，并推定出編碼內(nèi)溶素基因，利用基因工程技術(shù)對內(nèi)溶素基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，利用物理化學(xué)方法對重組內(nèi)溶素LysVPp1生物學(xué)活性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　1.對14株副溶血弧菌噬菌體進(jìn)行初步的篩選，通過增殖獲得高效價(jià)噬菌體、限制性內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，

3、并對裂解譜進(jìn)行了測定。研究中發(fā)現(xiàn)噬菌體VPp1增殖后可以獲得較高的效價(jià)、酶切鑒定為一株新型噬菌體、裂解3種副溶血弧菌、裂解液最澄清，并且前期研究結(jié)果表明噬菌體VPp1在檢測牡蠣中副溶血弧菌和控制牡蠣中副溶血弧菌方面有較好的表現(xiàn)，最終選取副溶血弧菌噬菌體VPp1進(jìn)行后續(xù)研究。本實(shí)驗(yàn)室已完成副溶血弧菌噬菌體VPp1的全基因組測序及初步基因組信息注釋，并已在GenBank上登錄(No.KJ936628)。
　　2.通過對副溶血弧菌噬菌體

4、VPp1全基因組分析，利用相似性比對數(shù)據(jù)庫BLAST和序列模體數(shù)據(jù)庫，初步推定該基因組的ORF31編碼內(nèi)溶素，預(yù)測該開放式閱讀框編碼一種糖苷水解酶。預(yù)測內(nèi)溶素等電點(diǎn)為4.58，質(zhì)量分?jǐn)?shù)28.2kDa，不含信號肽、跨膜區(qū)域，含有兩個(gè)疏水域、一個(gè)結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示其二級結(jié)構(gòu)主要是無規(guī)則卷曲，三級結(jié)構(gòu)與溶菌酶結(jié)構(gòu)具有相似性。從生物信息學(xué)角度推定噬菌體VPp1內(nèi)溶素的裂解機(jī)制可能是聯(lián)合孔蛋白協(xié)同作用裂解細(xì)菌肽聚糖。
　　3.選取p

5、ET克隆表達(dá)系統(tǒng)的pET-28a表達(dá)載體，以Rosetta(DE3)為宿主菌進(jìn)行內(nèi)溶素的重組表達(dá)，在最佳的誘導(dǎo)時(shí)間4h、溫度37℃和IPTG濃度0.1mmol/L條件下，誘導(dǎo)表達(dá)生成可溶性重組內(nèi)溶素LysVPp1;SDS-PAGE檢測重組內(nèi)溶素分子質(zhì)量大小約為40kDa;通過非變性Ni2+親和層析柱純化，10kDa截留超濾離心管除鹽和濃縮，最終獲得蛋白濃度為1mg/mL的重組內(nèi)溶素LysVPp1，于-20℃保存。
　　4.對重組內(nèi)

6、溶素LysVPp1的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究，測得其對細(xì)菌肽聚糖、死細(xì)菌和活菌均有較強(qiáng)裂解能力;LysVPp1作用條件較溫和，pH5-8時(shí)可保持較好的活性，55℃條件下30min仍能保持60％以上的活性，-20℃條件下保存半年仍有80％以上的活性。此外，低濃度Zn2+和Ca2+可以明顯提高LysVPp1活性。LysVPp1對15種副溶血弧菌中的9種顯示出裂解性，裂解譜比噬菌體VPp1裂解譜更寬。LysVPp1的特性表明其具有成為新型酶類抗生素的

7、潛力。
　　綜上所述，本研究首先通過噬菌體篩選得到優(yōu)勢噬菌體VPp1，序列與結(jié)構(gòu)分析提示副溶血弧菌噬菌體VPp1內(nèi)溶素可能是一種糖苷水解酶;對VPp1內(nèi)溶素基因進(jìn)行克隆和誘導(dǎo)表達(dá)，利用非變性的Ni-NTA柱親和層析和超濾濃縮，獲得純化的重組內(nèi)溶素LysVPp1;獲得的LysVPp1經(jīng)體外活性檢測證實(shí)，對副溶血弧菌細(xì)胞壁肽聚糖具有降解活性，并且對EDTA處理后死菌和活菌均有裂解活性。本研究豐富了噬菌體基因組注釋信息，填補(bǔ)了副溶血弧菌