布魯氏菌噬菌體裂解酶基因表達、生物活性鑒定及裂菌動力學研究.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌(簡稱布氏菌)引起的人畜共患傳染病，在我國被列為二類傳染病。全世界170多個國家和地區(qū)每年向WHO報告發(fā)病例數(shù)50萬例。在過去15年中，隨著經(jīng)濟政策等多方面的發(fā)展，加之各地重視程度的不同，疫區(qū)有了新的變化，以致很多發(fā)達國家也有流行。在我國布病波及28個省市區(qū)，并且近年疫情反彈、死灰復燃，對畜牧經(jīng)濟帶來巨大影響，以及對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。此外，布魯氏菌是一種標準的生物戰(zhàn)劑。由于其獨特的生物特征(幾個菌細胞即可造成感

2、染)和損傷效應(可通過氣溶膠感染并且形成胞內(nèi)寄生)，早在20世紀50年代布魯氏菌即被美軍列為B類標準生物戰(zhàn)劑，從戰(zhàn)略和戰(zhàn)術上被敵對方使用的可能性很大，這對我國和我軍的生物襲擊防護能力提出了新的挑戰(zhàn)，針對性開展生物防護成為軍事醫(yī)學的重要任務。雖然對布病的認識已經(jīng)存在近千年，但是在病原體致病機制、流行病學理論與控制技術、治療藥物、疫苗等領域的研究起步尚晚。目前a.布魯氏菌病畜用疫苗的安全性和有效性方面存在諸多局限性，而人用疫苗則至今沒有一種

3、安全、有效的產(chǎn)品；b.布病臨床治療時間長，耐藥問題亦十分嚴峻。如果選用耐藥菌進行生物恐怖襲擊，防治工作將十分困難；c.生物襲擊后大面積疫源地及疫區(qū)環(huán)境、物品洗消一般普遍采用高效的化學消毒劑進行處理，存在對物品、裝備的高度刺激、腐蝕，引起環(huán)境污染、病原體抗力增加，生態(tài)平衡破壞，環(huán)境沈消技術同樣亟待突破。因此基于上述三個因素，研制新一代安全、高效、價廉布魯氏菌病藥物成為我軍乃至我國的生命科學重要課題。 噬菌體，作為細菌的病毒，能夠特

4、異性的感染和裂解細菌。早在上個世紀二十年代，人們首次引入噬菌體來治療細菌的感染并取得了良好的效果。但隨著抗生素時代的來臨，這種治療方法的發(fā)展被忽略。近年來各種耐藥性菌株的大量出現(xiàn)，使人們再一次把目光集中到了噬菌體上，運用噬菌體，這種細菌的病毒來治療細菌性疾病，再一次引起了人們的極大關注。但是，由于應用對象和環(huán)境的特殊要求以及噬菌體本身生物特性的展現(xiàn)，直接應用天然噬菌體存在一些不足，如宿主菌耐受性，產(chǎn)生變態(tài)反應等局限。因此，噬菌體裂解酶的

5、“自外裂解”效應則成為擴大噬菌體生物制劑的應用范疇以及更好的提高其抗菌效應的科學基礎。諸多研究表明噬菌體裂解酶具有能夠破壞細菌胞壁質(zhì)的功能，如Nelson等通過體外和在體實驗證實噬菌體裂解酶能消除致病性鏈球菌的攜帶狀態(tài)而不破壞正常菌群，而且噬菌體裂解酶不會損害固有的黏膜細胞，具有較高的安全性，目前此酶己開始I期臨床試驗；Schuch等研究發(fā)現(xiàn)：重組的γ噬菌體裂解酶( PlyG)能引起炭疽敏感菌的裂解，并對感染炭疽的小鼠治愈率達到76.9

6、％。 布魯氏菌噬菌體有多種多價裂解型噬菌體株(如Tbilisi，Weybridge，Berkeley，F(xiàn)irenze等)，可直接作用多種布魯氏菌(含多種R型和S型)宿主細胞壁，效應的高親和性與種屬特異的細胞壁糖基部分有關，推斷細菌難以產(chǎn)生對裂解酶的抗性。因此，將其作為治療、洗消抗菌制劑具有明顯的優(yōu)勢，使之有可能成為專門破壞細菌的“生物酶學消毒劑”。 基于此，本文首先對布魯氏菌噬菌體國際參考株Tbilisi多價噬菌體進行生

7、物性質(zhì)和分子特征研究，并且針對噬菌體裂解酶進行基于生物信息學技術的結(jié)構(gòu)分析和功能域預測，隨后克隆了噬菌體裂解酶全長基因，并成功構(gòu)建了噬菌體裂解酶重組質(zhì)粒，隨后經(jīng)表達、純化獲得噬菌體裂解酶融合蛋白。最后，通過對噬菌體裂解酶的體外抑菌活性的鑒定和裂菌動力學分析來探討其作為抗菌制劑的應用前景。其研究內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個方面： 1.布魯氏菌噬菌體Tbilisi的生物性質(zhì)及分子特征：通過透射電鏡技術，噬斑觀察，基因組隨機擴增多態(tài)性分

8、析，TA克隆技術對噬菌體Tbilisi的生物性質(zhì)和分子特征進行全面分析，確定Tbilisi頭部直徑為57±2nm，短尾(32±3 nm長)，分類學屬于短尾噬菌體科。培養(yǎng)48小時后顯示清晰噬斑，大小為2～3mm：基因組DNA分析為短尾病毒科dsDNA噬菌體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH1酶切產(chǎn)生2條清晰條帶，表明分子量在34.5kb左右。SDS-PAGE全蛋白電泳顯示Tb噬菌體含有9條主要結(jié)構(gòu)蛋白，通過已完成的部分基因組分析工作，發(fā)現(xiàn)了包括噬菌

9、體裂解功能相關蛋白與噬菌體尾領蛋白等。 2.布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解作用關鍵酶的生物信息學分析：通過重點分析獲得的類似于噬菌體裂解功能的蛋白，經(jīng)過BLAST等初步確定為噬菌體裂解酶蛋白；通過跨膜域分析發(fā)現(xiàn)存在跨膜結(jié)構(gòu)，推定可能直接對宿主細胞壁產(chǎn)生作用：并結(jié)合分子遺傳與進化分析，神經(jīng)網(wǎng)絡預測二級結(jié)構(gòu)，通過同源建模技術模擬分析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，采用Verify3D，拉氏構(gòu)象圖等方法評價三維結(jié)構(gòu)的準確性，Procheck方法預測

10、氨基酸殘基89.2％在預測準確率最高區(qū)，9.2％在允許區(qū)，1.6％在一般區(qū)域(Va120，Asp109，Asn183，和Ser190)，沒有殘基在錯誤區(qū)域，對噬菌體裂解酶蛋白遺傳親緣關系進行分析，為遺傳操作提供目標，為設計新的蛋白質(zhì)或改造已有蛋白質(zhì)提供可靠的依據(jù)。LzA的最終模型采用了VERIFY3D驗證，其結(jié)果顯示超過90％的氨基酸殘基在準確的區(qū)域，即認為LzA同源建模模型的質(zhì)量良好。Ramachandran圖分析表明模型中所有氨基酸

11、殘基均分布在允許的范圍內(nèi)，模型中蛋白質(zhì)主鏈殘基的二面角構(gòu)象合理；Procheck評價表明模型的結(jié)構(gòu)和均方根z值大多在允許范圍內(nèi)，模型較為合理。同時，采用Protean模塊，結(jié)合Kyte-Doolittle親水性，Karplus-Schultz柔韌性，Jameson-Wolf抗原指數(shù)，Emini表面可能性方法預測，預測LzA的抗原指數(shù)，親水性，柔韌性及表面可能性區(qū)域在肽段上分布比較均勻，并且有部分的重疊，分別為第15-20、81-88、1

12、41-150、182-193、251-262、271-280位氨基酸殘基，推測這種重疊區(qū)域極有可能是LzA的B細胞抗原表位。為新的藥物分子設計提供合理的靶分子及結(jié)構(gòu)。 3.布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解酶全長基因的克隆：通過對布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解酶全長基因的擴增，將噬菌體裂解酶全長基因插入原核表達載體pET32a(+)，成功構(gòu)建了噬菌體裂解酶重組質(zhì)粒pET32a(+)-LzA。該重組質(zhì)粒經(jīng)位于噬菌體裂解酶目的片段5

13、'端的KpnI和3'端Xho I雙酶切鑒定后，對重組質(zhì)粒進行核苷酸測序，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。 4.布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解酶全長基因的表達與純化：將噬菌體裂解酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，獲得了表達穩(wěn)定的噬菌體裂解酶基因工程菌。在制備融合蛋白包涵體的過程中，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以分泌型表達為主，80％的融合蛋白存在于上清中。在上清中目的蛋白的表達量是包涵體表達量的4倍以上。故對融合蛋白上清行非變性的Nj

14、2+-NTA柱親和層析以及目的蛋白的分子篩層析純化后，能夠獲得單一條帶的目的蛋白，基本無雜蛋白的存在，蛋白純度在90％以上。說明采用非變性親和層析可以實現(xiàn)噬菌體裂解酶融合蛋白的一步純化。Bradford法測定目標蛋白濃度為10mg/ml。 5.噬菌體裂解酶融合蛋白裂菌動力學觀察：用挖孔法測定噬菌體裂解酶對布魯氏菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，在加入重組噬菌體Tb噬菌體裂解酶蛋白孔中，可形成了直徑約為0.5～2cm的透明圓環(huán)，而陰性對照的

15、孔中，無透明抑菌環(huán)的形成。初步證明噬菌體裂解酶基因蛋白對布魯氏菌具有一定的裂菌活性。 6.噬菌體裂解酶融合蛋白環(huán)境穩(wěn)定性研究：觀察了在不同酸堿性環(huán)境下，不同溫度和不同離子濃度的條件下的噬菌體裂解酶環(huán)境穩(wěn)定性。裂解酶的最適pH值為7.0。-20℃凍存六個月的酶活力約為原來的57.8％；4℃儲存六個月的酶活力約為原來的32.1％；25℃儲存50天的酶活力約為原來的14.3％；37℃儲存50天的酶活力約為原來的10.7％；50℃保存2

16、5min酶活力約為原來的7.9％；65℃保存lOmin的酶活力幾乎全部喪失。100mmol/LEDTA對酶沒有明顯的抑制作用；0-20mmol/LNaCl、0-20mmol/LMgCl2.0-10 mmoULCaCl2、0-10mmol/L ZnCl2對其活性有激活作用；海藻糖作為酶的保護劑，0-200mmol/L海藻糖對酶沒有明顯的激活或抑制作用。由此認為噬菌體裂解酶環(huán)境穩(wěn)定性較好，存在在外環(huán)境中使用的可能性。 綜上所述，本研

17、究通過對布魯氏菌噬菌體Tbilisi的分子特征進行分析，認識其屬于dsDNA短尾病毒科噬菌體，存在9條主要的結(jié)構(gòu)蛋白，并且獲得了尾領蛋白和噬菌體裂解酶蛋白等重要功能蛋白，結(jié)合生物信息學手段描述了布魯氏菌噬菌體裂解酶的三維結(jié)構(gòu)和功能預測，繼而結(jié)合分子生物學技術，擴增到噬菌體裂解酶全長885bp的基因，為制備噬菌體裂解酶融合蛋白奠定了基礎；同時，通過對噬菌體裂解酶的表達和純化，拿到了具有活性的重組噬菌體裂解酶融合蛋白，融合蛋白主要以可溶性蛋