布魯氏菌噬菌體裂解酶基因表達(dá)、生物活性鑒定及裂菌動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌(簡(jiǎn)稱(chēng)布氏菌)引起的人畜共患傳染病，在我國(guó)被列為二類(lèi)傳染病。全世界170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)每年向WHO報(bào)告發(fā)病例數(shù)50萬(wàn)例。在過(guò)去15年中，隨著經(jīng)濟(jì)政策等多方面的發(fā)展，加之各地重視程度的不同，疫區(qū)有了新的變化，以致很多發(fā)達(dá)國(guó)家也有流行。在我國(guó)布病波及28個(gè)省市區(qū)，并且近年疫情反彈、死灰復(fù)燃，對(duì)畜牧經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大影響，以及對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。此外，布魯氏菌是一種標(biāo)準(zhǔn)的生物戰(zhàn)劑。由于其獨(dú)特的生物特征(幾個(gè)菌細(xì)胞即可造成感

2、染)和損傷效應(yīng)(可通過(guò)氣溶膠感染并且形成胞內(nèi)寄生)，早在20世紀(jì)50年代布魯氏菌即被美軍列為B類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)生物戰(zhàn)劑，從戰(zhàn)略和戰(zhàn)術(shù)上被敵對(duì)方使用的可能性很大，這對(duì)我國(guó)和我軍的生物襲擊防護(hù)能力提出了新的挑戰(zhàn)，針對(duì)性開(kāi)展生物防護(hù)成為軍事醫(yī)學(xué)的重要任務(wù)。雖然對(duì)布病的認(rèn)識(shí)已經(jīng)存在近千年，但是在病原體致病機(jī)制、流行病學(xué)理論與控制技術(shù)、治療藥物、疫苗等領(lǐng)域的研究起步尚晚。目前a.布魯氏菌病畜用疫苗的安全性和有效性方面存在諸多局限性，而人用疫苗則至今沒(méi)有一種

3、安全、有效的產(chǎn)品；b.布病臨床治療時(shí)間長(zhǎng)，耐藥問(wèn)題亦十分嚴(yán)峻。如果選用耐藥菌進(jìn)行生物恐怖襲擊，防治工作將十分困難；c.生物襲擊后大面積疫源地及疫區(qū)環(huán)境、物品洗消一般普遍采用高效的化學(xué)消毒劑進(jìn)行處理，存在對(duì)物品、裝備的高度刺激、腐蝕，引起環(huán)境污染、病原體抗力增加，生態(tài)平衡破壞，環(huán)境沈消技術(shù)同樣亟待突破。因此基于上述三個(gè)因素，研制新一代安全、高效、價(jià)廉布魯氏菌病藥物成為我軍乃至我國(guó)的生命科學(xué)重要課題。 噬菌體，作為細(xì)菌的病毒，能夠特

4、異性的感染和裂解細(xì)菌。早在上個(gè)世紀(jì)二十年代，人們首次引入噬菌體來(lái)治療細(xì)菌的感染并取得了良好的效果。但隨著抗生素時(shí)代的來(lái)臨，這種治療方法的發(fā)展被忽略。近年來(lái)各種耐藥性菌株的大量出現(xiàn)，使人們?cè)僖淮伟涯抗饧械搅耸删w上，運(yùn)用噬菌體，這種細(xì)菌的病毒來(lái)治療細(xì)菌性疾病，再一次引起了人們的極大關(guān)注。但是，由于應(yīng)用對(duì)象和環(huán)境的特殊要求以及噬菌體本身生物特性的展現(xiàn)，直接應(yīng)用天然噬菌體存在一些不足，如宿主菌耐受性，產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)等局限。因此，噬菌體裂解酶的

5、“自外裂解”效應(yīng)則成為擴(kuò)大噬菌體生物制劑的應(yīng)用范疇以及更好的提高其抗菌效應(yīng)的科學(xué)基礎(chǔ)。諸多研究表明噬菌體裂解酶具有能夠破壞細(xì)菌胞壁質(zhì)的功能，如Nelson等通過(guò)體外和在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)噬菌體裂解酶能消除致病性鏈球菌的攜帶狀態(tài)而不破壞正常菌群，而且噬菌體裂解酶不會(huì)損害固有的黏膜細(xì)胞，具有較高的安全性，目前此酶己開(kāi)始I期臨床試驗(yàn)；Schuch等研究發(fā)現(xiàn)：重組的γ噬菌體裂解酶( PlyG)能引起炭疽敏感菌的裂解，并對(duì)感染炭疽的小鼠治愈率達(dá)到76.9

6、％。 布魯氏菌噬菌體有多種多價(jià)裂解型噬菌體株(如Tbilisi，Weybridge，Berkeley，F(xiàn)irenze等)，可直接作用多種布魯氏菌(含多種R型和S型)宿主細(xì)胞壁，效應(yīng)的高親和性與種屬特異的細(xì)胞壁糖基部分有關(guān)，推斷細(xì)菌難以產(chǎn)生對(duì)裂解酶的抗性。因此，將其作為治療、洗消抗菌制劑具有明顯的優(yōu)勢(shì)，使之有可能成為專(zhuān)門(mén)破壞細(xì)菌的“生物酶學(xué)消毒劑”。 基于此，本文首先對(duì)布魯氏菌噬菌體國(guó)際參考株Tbilisi多價(jià)噬菌體進(jìn)行生

7、物性質(zhì)和分子特征研究，并且針對(duì)噬菌體裂解酶進(jìn)行基于生物信息學(xué)技術(shù)的結(jié)構(gòu)分析和功能域預(yù)測(cè)，隨后克隆了噬菌體裂解酶全長(zhǎng)基因，并成功構(gòu)建了噬菌體裂解酶重組質(zhì)粒，隨后經(jīng)表達(dá)、純化獲得噬菌體裂解酶融合蛋白。最后，通過(guò)對(duì)噬菌體裂解酶的體外抑菌活性的鑒定和裂菌動(dòng)力學(xué)分析來(lái)探討其作為抗菌制劑的應(yīng)用前景。其研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.布魯氏菌噬菌體Tbilisi的生物性質(zhì)及分子特征：通過(guò)透射電鏡技術(shù)，噬斑觀(guān)察，基因組隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分

8、析，TA克隆技術(shù)對(duì)噬菌體Tbilisi的生物性質(zhì)和分子特征進(jìn)行全面分析，確定Tbilisi頭部直徑為57±2nm，短尾(32±3 nm長(zhǎng))，分類(lèi)學(xué)屬于短尾噬菌體科。培養(yǎng)48小時(shí)后顯示清晰噬斑，大小為2～3mm：基因組DNA分析為短尾病毒科dsDNA噬菌體，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BamH1酶切產(chǎn)生2條清晰條帶，表明分子量在34.5kb左右。SDS-PAGE全蛋白電泳顯示Tb噬菌體含有9條主要結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)已完成的部分基因組分析工作，發(fā)現(xiàn)了包括噬菌

9、體裂解功能相關(guān)蛋白與噬菌體尾領(lǐng)蛋白等。 2.布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解作用關(guān)鍵酶的生物信息學(xué)分析：通過(guò)重點(diǎn)分析獲得的類(lèi)似于噬菌體裂解功能的蛋白，經(jīng)過(guò)BLAST等初步確定為噬菌體裂解酶蛋白；通過(guò)跨膜域分析發(fā)現(xiàn)存在跨膜結(jié)構(gòu)，推定可能直接對(duì)宿主細(xì)胞壁產(chǎn)生作用：并結(jié)合分子遺傳與進(jìn)化分析，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)同源建模技術(shù)模擬分析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，采用Verify3D，拉氏構(gòu)象圖等方法評(píng)價(jià)三維結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，Procheck方法預(yù)測(cè)

10、氨基酸殘基89.2％在預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率最高區(qū)，9.2％在允許區(qū)，1.6％在一般區(qū)域(Va120，Asp109，Asn183，和Ser190)，沒(méi)有殘基在錯(cuò)誤區(qū)域，對(duì)噬菌體裂解酶蛋白遺傳親緣關(guān)系進(jìn)行分析，為遺傳操作提供目標(biāo)，為設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)或改造已有蛋白質(zhì)提供可靠的依據(jù)。LzA的最終模型采用了VERIFY3D驗(yàn)證，其結(jié)果顯示超過(guò)90％的氨基酸殘基在準(zhǔn)確的區(qū)域，即認(rèn)為L(zhǎng)zA同源建模模型的質(zhì)量良好。Ramachandran圖分析表明模型中所有氨基酸

11、殘基均分布在允許的范圍內(nèi)，模型中蛋白質(zhì)主鏈殘基的二面角構(gòu)象合理；Procheck評(píng)價(jià)表明模型的結(jié)構(gòu)和均方根z值大多在允許范圍內(nèi)，模型較為合理。同時(shí)，采用Protean模塊，結(jié)合Kyte-Doolittle親水性，Karplus-Schultz柔韌性，Jameson-Wolf抗原指數(shù)，Emini表面可能性方法預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)LzA的抗原指數(shù)，親水性，柔韌性及表面可能性區(qū)域在肽段上分布比較均勻，并且有部分的重疊，分別為第15-20、81-88、1

12、41-150、182-193、251-262、271-280位氨基酸殘基，推測(cè)這種重疊區(qū)域極有可能是LzA的B細(xì)胞抗原表位。為新的藥物分子設(shè)計(jì)提供合理的靶分子及結(jié)構(gòu)。 3.布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解酶全長(zhǎng)基因的克?。和ㄟ^(guò)對(duì)布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解酶全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增，將噬菌體裂解酶全長(zhǎng)基因插入原核表達(dá)載體pET32a(+)，成功構(gòu)建了噬菌體裂解酶重組質(zhì)粒pET32a(+)-LzA。該重組質(zhì)粒經(jīng)位于噬菌體裂解酶目的片段5

13、'端的KpnI和3'端Xho I雙酶切鑒定后，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測(cè)序，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。 4.布魯氏菌噬菌體Tbilisi裂解酶全長(zhǎng)基因的表達(dá)與純化：將噬菌體裂解酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，獲得了表達(dá)穩(wěn)定的噬菌體裂解酶基因工程菌。在制備融合蛋白包涵體的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以分泌型表達(dá)為主，80％的融合蛋白存在于上清中。在上清中目的蛋白的表達(dá)量是包涵體表達(dá)量的4倍以上。故對(duì)融合蛋白上清行非變性的Nj

14、2+-NTA柱親和層析以及目的蛋白的分子篩層析純化后，能夠獲得單一條帶的目的蛋白，基本無(wú)雜蛋白的存在，蛋白純度在90％以上。說(shuō)明采用非變性親和層析可以實(shí)現(xiàn)噬菌體裂解酶融合蛋白的一步純化。Bradford法測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度為10mg/ml。 5.噬菌體裂解酶融合蛋白裂菌動(dòng)力學(xué)觀(guān)察：用挖孔法測(cè)定噬菌體裂解酶對(duì)布魯氏菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，在加入重組噬菌體Tb噬菌體裂解酶蛋白孔中，可形成了直徑約為0.5～2cm的透明圓環(huán)，而陰性對(duì)照的

15、孔中，無(wú)透明抑菌環(huán)的形成。初步證明噬菌體裂解酶基因蛋白對(duì)布魯氏菌具有一定的裂菌活性。 6.噬菌體裂解酶融合蛋白環(huán)境穩(wěn)定性研究：觀(guān)察了在不同酸堿性環(huán)境下，不同溫度和不同離子濃度的條件下的噬菌體裂解酶環(huán)境穩(wěn)定性。裂解酶的最適pH值為7.0。-20℃凍存六個(gè)月的酶活力約為原來(lái)的57.8％；4℃儲(chǔ)存六個(gè)月的酶活力約為原來(lái)的32.1％；25℃儲(chǔ)存50天的酶活力約為原來(lái)的14.3％；37℃儲(chǔ)存50天的酶活力約為原來(lái)的10.7％；50℃保存2

16、5min酶活力約為原來(lái)的7.9％；65℃保存lOmin的酶活力幾乎全部喪失。100mmol/LEDTA對(duì)酶沒(méi)有明顯的抑制作用；0-20mmol/LNaCl、0-20mmol/LMgCl2.0-10 mmoULCaCl2、0-10mmol/L ZnCl2對(duì)其活性有激活作用；海藻糖作為酶的保護(hù)劑，0-200mmol/L海藻糖對(duì)酶沒(méi)有明顯的激活或抑制作用。由此認(rèn)為噬菌體裂解酶環(huán)境穩(wěn)定性較好，存在在外環(huán)境中使用的可能性。 綜上所述，本研

17、究通過(guò)對(duì)布魯氏菌噬菌體Tbilisi的分子特征進(jìn)行分析，認(rèn)識(shí)其屬于dsDNA短尾病毒科噬菌體，存在9條主要的結(jié)構(gòu)蛋白，并且獲得了尾領(lǐng)蛋白和噬菌體裂解酶蛋白等重要功能蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)手段描述了布魯氏菌噬菌體裂解酶的三維結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，繼而結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，擴(kuò)增到噬菌體裂解酶全長(zhǎng)885bp的基因，為制備噬菌體裂解酶融合蛋白奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)，通過(guò)對(duì)噬菌體裂解酶的表達(dá)和純化，拿到了具有活性的重組噬菌體裂解酶融合蛋白，融合蛋白主要以可溶性蛋