HIV-1整合酶的生物活性及酶動力學(xué)分析.pdf

1、全文分為二部分：一.HIV-1整合酶的表達(dá)和生物活性分析 [目的]： 整合酶(integrase)是人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)基因編碼的蛋白質(zhì)，由前期融合蛋白Pr160gag-pol經(jīng)病毒自身編碼的蛋白酶作用形成的產(chǎn)物。整合酶催化HIV逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA整合至宿主DNA上，在HIV復(fù)制中起著關(guān)鍵的作用；由于正常宿主細(xì)胞沒有整合酶，因此整合酶是設(shè)計HIV病毒抑制

2、劑的良好靶點。在整合反應(yīng)過程中，整合酶表現(xiàn)出四種活性：DNA結(jié)合、DNA3’末端加工、末端轉(zhuǎn)移(病毒DNA整合進(jìn)宿主DNA)、去整合。[2]在結(jié)合到雙鏈平末端病毒DNA(供體DNA)后，整合酶切去3’端二個核苷—GT，然后切割宿主DNA的5’末端，并將病毒DNA整合進(jìn)宿主DNA(受體DNA)。整合過程是可逆的，當(dāng)整合DNA產(chǎn)物的類似物存在時，整合酶可將原整合產(chǎn)物重新分解為病毒DNA和宿主DNA部分。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示：整合酶由三個結(jié)構(gòu)域組

3、成：1、N-末端結(jié)構(gòu)域，包含一個鋅指結(jié)構(gòu)。2、中心區(qū)，包含酶的催化中心。3、C-末端結(jié)構(gòu)域，非特異性結(jié)合DNA。因為以前普遍采用的方法使用帶有放射性標(biāo)記的病毒DNA底物，和整合酶共育后，經(jīng)過變性膠電泳以及放射自顯影，顯示整合酶反應(yīng)的產(chǎn)物。但這種實驗都有耗時較長及放射線污染的缺點。本文旨在建立一種快速簡便安全的體外篩選HIV-1整合酶抑制劑的方法。 [結(jié)論]： 重組的HIV-1型整合酶蛋白具有較高的病毒DNA3'末端加工，

4、病毒DNA整合活性。本實驗所采用的基于BA-ELISA的篩選方法適合于大規(guī)模體外HIV-1整合酶抑制劑的篩選以及對其抑制作用的動力學(xué)分析。 二.Luffin-a入核突變體基因的構(gòu)建和表達(dá)及其對HIV-1整合酶的抑制作用 [目的]：luffin-a是一種核糖體失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein，RIP)和其他RIP一樣，它能夠特異性地在28SrRNA脫去腺嘌呤堿基，從而抑制蛋白質(zhì)合成，而且試驗