大腸桿菌噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17的表達(dá)、抗菌效應(yīng)分析及優(yōu)化設(shè)計預(yù)測.pdf

1、自噬菌體被發(fā)現(xiàn)以來便廣發(fā)被用于抗菌相關(guān)研究。但是自弗萊明于1928年意外發(fā)現(xiàn)青霉素作為抗菌藥物以后,由于抗生素治療效果顯著,且噬菌體研究不夠成熟,利用噬菌體進行抗菌一直處于擱置狀態(tài)。2001年Nelson等通過重組表達(dá)獲得了純化的噬菌體裂解酶并將其作為抗菌物質(zhì)進行研究。近年來,隨著耐藥菌的廣泛產(chǎn)生以及環(huán)境保護面臨嚴(yán)峻壓力,以及抗生素的研發(fā)周期遠(yuǎn)長于細(xì)菌對該物質(zhì)產(chǎn)生耐藥的周期,對噬菌體抗菌功能的探索及應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)逐漸成為醫(yī)學(xué)研究熱點之一

2、。噬菌體的天然抗菌效應(yīng)和通過分子生物學(xué)技術(shù)人工修飾的改良產(chǎn)物表現(xiàn)特色給環(huán)境凈化、水體凈化、食物安全及臨床抗菌應(yīng)用開辟了新的發(fā)展方向。2013年歐洲還成立了PhagoBurn項目專門用于研究噬菌體治療燒傷后大腸桿菌和綠膿桿菌感染問題。
　　噬菌體作為細(xì)菌病毒,能夠特異性識別和裂解細(xì)菌,其滅菌效應(yīng)被越來越多的研究者關(guān)注。噬菌體裂解酶作為噬菌體在進入細(xì)菌之前溶解細(xì)胞壁以及在宿主體內(nèi)繁殖之后裂解細(xì)菌、釋放子代噬菌體的關(guān)鍵酶,現(xiàn)正受到越來越

3、多的研究者的重視并對其進行進一步研究。
　　本教研室在醫(yī)院的污水池中分離到一株大腸桿菌噬菌體并將其命名為LSB-1,初步研究發(fā)現(xiàn)了該噬菌體裂解細(xì)菌的相關(guān)酶基因gp17,并對其進行測序后提交至GenBank(GenBank序列號:KC425724.1)。本研究通過原核表達(dá)技術(shù)將唾液酸酶基因克隆到質(zhì)粒pET300構(gòu)建重組質(zhì)粒pET300-gp17,然后再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達(dá),并對表達(dá)的蛋白進行純化,最

4、終獲得了gp17基因表達(dá)的純化蛋白。采用KB紙片法對純化重組蛋白的有效菌譜進行測定,并將測定結(jié)果與通過噬菌體展示技術(shù)將gp17基因重組到T7噬菌體得到的T7-LSB-gp17重組噬菌體的有效菌譜進行比較,并對其結(jié)果進行分析。為了進一步提高酶活性,擬對gp17唾液酸酶的關(guān)鍵氨基酸進行突變以增強其活性,并用AutoDock分子對接軟件對替換后的蛋白和唾液酸進行對接以查看替換后蛋白和唾液酸的結(jié)合效果。研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.唾液酸

5、酶基因的克隆、表達(dá)和純化:利用基因重組技術(shù)將EIEC8401噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17構(gòu)建到表達(dá)載體質(zhì)粒pET300中,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)及純化,最終獲得了gp17基因通過重組成功表達(dá)出分子量為78kDa的溶解蛋白;利用BCA法測定純化重組蛋白的含量,純化后濃度為2.38mg/ml。
　　2.利用抑菌實驗檢測重組蛋白的抑菌活性:以大腸桿菌、葡萄球菌等多種細(xì)菌等為試驗菌采用Kirby-Bauer紙片法對

6、重組噬菌體唾液酸酶的有效作用菌譜進行測定,發(fā)現(xiàn)重組噬菌體酶對噬菌體宿主菌EIEC8401有良好的抑菌作用,經(jīng)過5小時的培養(yǎng)能夠見到直徑約為2cm、明顯的抑菌圈,對其他種類的細(xì)菌無明顯抑菌作用,顯示該噬菌體酶具有高度特異性,這種特異性與T7噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)物(重組噬菌體T7-LSB-gp17較寬的宿主譜)不同。
　　3.采用結(jié)構(gòu)域單獨表達(dá)法與非保守位點突變法為理論依據(jù)設(shè)計突變體,通過AutoDock軟件分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)將結(jié)構(gòu)域直接進行

7、表達(dá)(突變體2)以及非保守位點124位(突變體6)和167位(突變體7)的天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸獲得的突變體進行表達(dá)獲得突變體具有結(jié)合能更低、與底物結(jié)合能力更強。用信息技術(shù)對突變體進行顯示了生物信息學(xué)差異。
　　綜上所述,本研究將噬菌體裂解細(xì)菌的唾液酸酶進行克隆、表達(dá)和純化獲得目的蛋白,進行體外活性檢測發(fā)現(xiàn)其對EIEC8401有較好的特異性,其結(jié)果與通過噬菌體展示技術(shù)獲得的重組噬菌體T7-LSB-gp17有較大的差異;通過對酶的相關(guān)