結(jié)核分枝桿菌噬菌體SWU1多糖解聚酶基因A321gp39的克隆表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、結(jié)核病是一種危害人類公共健康的重大傳染性疾病。結(jié)核病的致病菌是結(jié)核分枝桿菌。近年來，由于全球艾滋病的流行、人口流動(dòng)性的增加、耐多藥菌株的出現(xiàn)，使全球結(jié)核病疫情進(jìn)一步加重，全世界每年約有三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，約有兩百萬人死于結(jié)核病，結(jié)核病已成為僅次于艾滋病的第二大致死性感染性疾病。目前，治療結(jié)核病的方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)治療方法，如異煙肼，利福平等，但隨著其耐藥性的增加導(dǎo)致這些藥物的治療效果越來越不理想，因此急需開發(fā)新型有效的快速

2、診斷和治療方法。
　　噬菌體是一種細(xì)菌的病毒，能夠特異性的感染宿主細(xì)菌。多糖解聚酶是一種由噬菌體編碼產(chǎn)生的具有降解莢膜多糖以及宿主胞外多糖的大分子碳水化合物的酶類。目前已知的大多數(shù)噬菌體屬于有尾噬菌體或者有尾噬菌體目，屬于C群噬菌體組。這些噬菌體在感染被莢膜包裹的某些宿主細(xì)菌的過程中，可在噬菌斑的外部形成一個(gè)圓形的暈環(huán)狀暈圈，這些暈圈的形成可能是由于在感染的過程中，噬菌體產(chǎn)生的大量的多糖解聚酶在瓊脂平板上擴(kuò)散并將噬菌斑周圍的宿主菌

3、降解造成的。研究發(fā)現(xiàn)這些多糖解聚酶的形成可能與噬菌體的尾部刺突結(jié)構(gòu)有關(guān)。目前已經(jīng)在銅綠假單胞菌噬菌體、肺炎克雷伯氏菌噬菌體、釀膿鏈球菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體等中發(fā)現(xiàn)有噬菌體多糖解聚酶的存在。這些酶主要包括降解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層骨架的一些內(nèi)溶素裂解酶、降解細(xì)菌脂多糖O抗原的內(nèi)鼠李糖苷酶以及降解細(xì)菌莢膜多糖的海藻酸裂解酶和內(nèi)唾液酸酶等。但目前還未有報(bào)道在結(jié)核分枝桿菌噬菌體中發(fā)現(xiàn)有這種解聚酶活性的裂解酶。
　　SWU1是一株新分離的結(jié)核

4、分枝桿菌噬菌體。該噬菌體形成的噬菌斑具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征。其噬菌斑形態(tài)為在噬菌斑的外部形成一個(gè)環(huán)形的暈環(huán)狀暈圈，在噬菌斑的中心產(chǎn)生一個(gè)渾濁的區(qū)域，這種噬菌斑特征與產(chǎn)生解聚酶噬菌體的噬菌斑特征相一致。本文使用MEGA4軟件對與SWU1同源的噬菌體進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示SWU1噬菌體與一種溫和型的L5噬菌體具有較高的親緣性，其噬菌體基因組相似度高達(dá)80％，但L5并不形成暈環(huán)狀噬菌斑。因此為了尋找兩種噬菌體形成不同噬菌斑的原因，對SWU1與L

5、5噬菌體基因組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在SWU1噬菌體的基因組中存在著一個(gè)特殊的基因即A321gp39。其在NCBI中注釋為利什曼溶樣蛋白肽(leishmanolysin-like peptidase)，其氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)其與大腸桿菌4_1_40B噬菌體(Escherichia sp.4_1_40B phage)的尾部刺突蛋白（TailspikeProtein, TSP）具有一定的相似性（相似度為41％）。HHpred分析結(jié)果顯示，其N末端具有

6、一個(gè)糖苷水解酶催化活性中心。因此，推測其可能是一種多糖水解酶，并且可能參與SWU1噬菌體外部環(huán)形暈圈的形成。這里我們克隆表達(dá)了A321gp39基因，并純化出了A321gp39的蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A321gp39具有降解恥垢分枝桿菌菌苔和恥垢分枝桿菌生物膜多糖的活性。此外，成功構(gòu)建了M.s-pALACE-A321 gp39的重組恥垢分枝桿菌，SDS-PAGE和Western-Blot檢測其在恥垢中穩(wěn)定表達(dá)。與M.s-pALACE空載恥垢