分枝桿菌細(xì)胞壁相關(guān)毒力基因的分離鑒定和功能研究及噬菌體報(bào)告系統(tǒng)在快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病是一種對(duì)人類健康及社會(huì)穩(wěn)定構(gòu)成嚴(yán)重威脅的傳染性疾病。在上個(gè)世紀(jì)中期，隨著各種抗結(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)，人類對(duì)于結(jié)核病的控制取得了輝煌的成就。但是隨著耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)及流行，HIV和結(jié)核菌的共感染，結(jié)核病這種“白色瘟疫”又有重新抬頭的趨勢(shì)。結(jié)核分枝桿菌獨(dú)特的細(xì)胞壁上諸多的毒力相關(guān)因子在其致病中起到了重要的作用。篩選出這些毒力相關(guān)因子，闡明其代謝途徑及功能可以幫助我們進(jìn)一步理解結(jié)核菌的致病機(jī)制，為尋求新的治療結(jié)核的手段提供理論基礎(chǔ)。另一方面，

2、傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)耗時(shí)久，難以對(duì)臨床結(jié)核病的治療發(fā)揮及時(shí)的指導(dǎo)作用，因此開發(fā)一種廉價(jià)但快速的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性檢測(cè)方法對(duì)指導(dǎo)耐藥結(jié)核病的治療以及控制其傳播具有重要意義。全文分兩部分： 第一部分海分枝桿菌細(xì)胞壁毒力相關(guān)基因的分離鑒定及其功能研究因生長(zhǎng)相對(duì)快速、對(duì)人體危害小，海分枝桿菌正越來越多的被作為一種研究致病性分枝桿菌的模型。利用MycoMarT7噬菌體轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，我們建立了海分枝桿菌的隨機(jī)突變庫。以細(xì)菌在固體

3、培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)改變以及顯微鏡下的索狀結(jié)構(gòu)改變?yōu)闃?biāo)志，篩選出兩個(gè)索狀結(jié)構(gòu)突變株——02C4和02C10突變株，其插入失活的基因與結(jié)核分枝桿菌基因ppsA和mas基因高度同源。ppsA和mas均為結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁毒力因子PDIM合成通路上的重要基因。經(jīng)細(xì)胞壁脂質(zhì)成分的薄層色譜分析證實(shí)該兩株海分枝桿菌突變株細(xì)胞壁的PDIM均缺失。我們重點(diǎn)研究了02C10 ⊿mas突變株。02C10 ⊿mas在體外環(huán)境中的生長(zhǎng)速度與野生株并無差異，掃描電

4、鏡下微觀結(jié)構(gòu)改變不顯著，但是在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、繁殖受到抑制，注射入斑馬魚腹腔后對(duì)斑馬魚的致死力急劇下降，并且不形成肉芽腫病理改變。因此，PDIM對(duì)于海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞以及宿主體內(nèi)的存活非常重要，這一結(jié)論與結(jié)核菌中研究結(jié)果相一致。本課題利用MycoMarT7噬菌體建立了海分枝桿菌隨機(jī)突變庫，以海分枝桿菌為模型篩選出兩個(gè)分枝桿菌細(xì)胞壁毒力相關(guān)基因，并建立了海分枝桿菌的毒力檢測(cè)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)PDIM在海分枝桿菌的致病性中起到重要重要的作用。

5、 第二部分應(yīng)用噬菌體報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性本研究旨在建立快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性的噬菌體報(bào)告系統(tǒng)(LRPs)，評(píng)估其在檢測(cè)異煙肼(INH)，利福平(RFP)，鏈霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)敏感性中的應(yīng)用價(jià)值。 應(yīng)用LRPs檢測(cè)49株WHO質(zhì)控菌株及57株臨床菌株共計(jì)106株轉(zhuǎn)種的新鮮結(jié)核分枝桿菌對(duì)四種藥物的敏感性，并與比例法相比較。LRPs與比例法對(duì)這四種藥物耐藥檢測(cè)的一致率分別為93.4％，96.2

6、％，93.4％和84.9％；以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，LRPs對(duì)這四種藥物耐藥檢測(cè)的敏感度分別為98.0％，96.9％，90.4％和75.0％，特異度分別為89.5％，96.0％，96.3％和87.2％。經(jīng)配對(duì)x<'2>檢驗(yàn)分析，對(duì)于轉(zhuǎn)種過的新鮮菌株，LRPs與比例法對(duì)四種藥物耐藥的檢測(cè)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨后，我們應(yīng)用LRPs直接檢測(cè)了157株上海市疾病預(yù)防控制中心收集的痰培養(yǎng)菌株的藥物敏感性。結(jié)果只有39株的LRPs檢測(cè)結(jié)果有效，其對(duì)INH，R

7、FP，SM和EMB的藥敏檢測(cè)結(jié)果與比例法的一致率分別為79.5％，87.2％，97.4％和66.7％。重新轉(zhuǎn)種兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的菌株，再次用LRPs法檢測(cè)后，LRPs對(duì)IRSE四種藥物的藥敏結(jié)果與比例法的一致率達(dá)到了92.3％，94.9％，97.4％和79.5％。 噬菌體報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)固體培養(yǎng)基上新鮮的結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性準(zhǔn)確快速、可重復(fù)性強(qiáng)。但是對(duì)于上海市疾病預(yù)防控制中心模式下的痰培養(yǎng)標(biāo)本的直接檢測(cè)有效率不高，錯(cuò)誤較多，