分枝桿菌噬菌體的系統(tǒng)生物學(xué)研究.pdf

1、分枝桿菌屬是隸屬于放線菌目的一類細(xì)菌，兩種常見的致病菌:結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosi）以及麻風(fēng)分枝桿菌（M.leprae）都是分枝桿菌屬內(nèi)的一員。自從1981年衛(wèi)生部提出20世紀(jì)末基本消滅麻風(fēng)的目標(biāo)后，目前由麻風(fēng)分枝桿菌引起的麻風(fēng)病在我國已得到有效的控制。而由結(jié)核分枝桿菌所引起的結(jié)核病則因?yàn)槿找鎳?yán)重的耐藥性、與HIV的共感染以及卡介苗的不穩(wěn)定性等呈現(xiàn)重新蔓延的趨勢(shì)?？刂平Y(jié)核病已成為科研及醫(yī)療工作者所面

2、臨的巨大任務(wù)。
　　分枝桿菌噬菌體是一類可感染分枝桿菌屬細(xì)菌的噬菌體，對(duì)其研究起始于1950s。隨著研究的深入，分枝桿菌噬菌體已成為控制結(jié)核病的重要工具，比如:分枝桿菌噬菌體以及其衍生物已逐漸被開發(fā)為基礎(chǔ)研究中分枝桿菌的遺傳操作載體和臨床上（耐藥）結(jié)核菌的有效診斷工具;部分噬菌體組分也被研究，其中的一些被認(rèn)為具有開發(fā)為新一代抗結(jié)核藥物的潛力。但令人遺憾的是，現(xiàn)在基于分枝桿菌噬菌體開發(fā)出的結(jié)核菌分子操作載體以及結(jié)核病診斷工具的專利權(quán)

3、都集中在歐美。因此為了對(duì)我國開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的結(jié)核病控制工具提供源頭上的創(chuàng)新，分離中國特有的分枝桿菌噬菌體并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序勢(shì)在必行。另外，研究分枝桿菌噬菌體與宿主菌相互作用的機(jī)理、一些噬菌體宿主關(guān)閉蛋白的功能、分枝桿菌原噬菌體多樣性及其與結(jié)核菌致病性的關(guān)系都為利用噬菌體控制結(jié)核病提供了基礎(chǔ)?；谝陨蠋c(diǎn)，本論文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行研究:
　　首先我們分離得到了一株新的分枝桿菌噬菌體，并將其命名為SWU1。這株噬菌體感染

4、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis mc2155)后形成周圍有暈環(huán)的牛眼狀噬菌斑，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其為典型的蝌蚪狀。得到其全基因組序列后，分析發(fā)現(xiàn)其屬于分枝桿菌噬菌體A2群體。針對(duì)SWU1與L5(A2群體典型噬菌體)表型的不同，進(jìn)行了遺傳學(xué)上的解釋，分析認(rèn)為SWU1中的gp39可能具有多糖解聚酶的功能。
　　在分離分枝桿菌噬菌體SWU1的過程中，我們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的分枝桿菌噬菌體分類鑒定方法具有較大的缺點(diǎn)，如必須進(jìn)行全基因組測(cè)序、花費(fèi)較大

5、等。為了解決這一難題，我們開發(fā)了一種新的基于保守基因的分枝桿菌噬菌體鑒定新方法。利用68個(gè)可獲取全基因組的分枝桿菌噬菌體，我們首先獲得分枝桿菌噬菌體的核心基因組。之后，我們分析了其中的核心基因，發(fā)現(xiàn)A類核心基因非常保守，最適合被用來鑒定分枝桿菌噬菌體。最后，針對(duì)A類核心基因的保守位點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)不同分枝桿菌噬菌體簇的引物對(duì)。其中針對(duì)分枝桿菌噬菌體A2簇的引物被驗(yàn)證是可行的。
　　作為細(xì)菌的病毒，噬菌體在進(jìn)化過程中獲得了一些可控

6、制宿主細(xì)菌正常生理代謝的蛋白質(zhì)。而這些蛋白質(zhì)本身或其作用位點(diǎn)、作用方式是開發(fā)新型抗生素的模型。為了更好的了解分枝桿菌噬菌體是如何侵染、控制其宿主菌的，我們首次利用RNA-seq技術(shù)研究了分枝桿菌噬菌體SWU1與其宿主恥垢分枝桿菌的互作。數(shù)據(jù)分析顯示，宿主會(huì)有一些防御噬菌體的反應(yīng)，比如，誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)從全局應(yīng)對(duì)噬菌體的感染，上調(diào)細(xì)胞壁合成基因試圖修復(fù)被噬菌體破壞的細(xì)胞壁。在此過程，噬菌體也劫持了菌體的蛋白質(zhì)、DNA及RNA的合成系統(tǒng)，破

7、壞了菌體的鐵攝取系統(tǒng)以幫助自身的繁殖。其中破壞分枝桿菌的鐵攝取系統(tǒng)也許是開發(fā)新型抗結(jié)核藥物的新理念。
　　依靠RNA-seq技術(shù)從全局上了解到宿主菌與噬菌體SWU1的相互作用后，我們更想知道的是單個(gè)蛋白質(zhì)在噬菌體侵染宿主菌過程中所發(fā)揮的功能。其中分枝桿菌噬菌體D29的gp34.1吸引了我們。這一蛋白存在一個(gè)DUF2637超家族結(jié)構(gòu)域。在恥垢分枝桿菌內(nèi)表達(dá)此蛋白質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)改變，且重組菌獲得耐受噬菌體TM4的表型。噬菌體仍然

8、可以正常的吸附并將DNA注入進(jìn)重組菌體內(nèi)。進(jìn)一步研究顯示其可抑制大腸桿菌的生長，是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的宿主關(guān)閉蛋白。通過蛋白截短實(shí)驗(yàn)探索到D29 gp34.1具有宿主毒性的核心作用區(qū)域?yàn)榈?6個(gè)氨基酸到第100個(gè)氨基酸區(qū)段的肽段。我們認(rèn)為這一多肽片段具有開發(fā)為新型抗生素骨架的潛力。
　　有研究表明分枝桿菌基因組內(nèi)存在大量的原噬菌體，為了更好的了解噬菌體與分枝桿菌致病性的關(guān)系，我們對(duì)分枝桿菌基因組內(nèi)的原噬菌體進(jìn)行了系統(tǒng)的挖掘、比較并探討了其