結核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥性的噬菌體檢測技術與耐藥基因突變研究.pdf

1、結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的一種慢性傳染性疾病，是現(xiàn)在世界上最普遍和最嚴重的人類傳染病之一，也是全世界由單一致病菌致死最多的疾病之一。由于耐藥性結核桿菌的出現(xiàn)與傳播、艾滋病的流行以及人口的頻繁流動等原因，結核病疫情呈現(xiàn)全球性的回升。吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)是治療結核病最有效的一線藥物之一，快速準確的PZA耐藥性檢測技術對臨床治療及

2、控制結核病具有重要的意義。吡嗪酰胺耐藥的精確的分子機理還未被闡明，對吡嗪酰胺耐藥相關基因pncA的突變進行研究有很大的理論及應用參考意義。 [目的]本研究旨在建立起結核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥性的噬菌體生物擴增(PhageAmplofiedBiologicallyAssay，PhaB)快速檢測方法，并探討和評價所建方法的實際應用價值；同時對結核分枝桿菌PZA耐藥菌株的PZA耐藥相關基因pncA的突變進行研究，對PZA耐藥機制進行初步

3、探索，為以后進行PZA耐藥機制研究提供相關實驗基礎。 [方法]應用PhaB法，對液體培養(yǎng)基的pH值、PZA藥物濃度、藥物作用時間進行一系列實驗，通過正交法篩選和優(yōu)化檢測條件，并對不同的噬菌體侵染環(huán)境的恢復方法進行比較來確定最佳恢復方法；應用所建方法對109株結核分枝桿菌臨床分離株進行PZA耐藥性的測定，并將檢測結果與常規(guī)藥敏檢測方法結果進行比較，對兩種方法檢測結果不相符的菌株進行最低抑菌濃度(minimuminhibitoryc

4、oncentration，MIC)測定，以探討和評價所建方法的應用價值；將結核分枝桿菌PZA耐藥株的耐藥相關基因pncA進行PCR擴增后對全基因進行測序，對pncA基因突變進行研究。 [結果]PhaB法檢測PZA耐藥性的最佳條件為液體培養(yǎng)基pH值為5.5、PZA藥物濃度200ug/ml、37℃作用48小時，確定離心洗滌為噬菌體侵染環(huán)境的恢復方法。對109株結核分枝桿菌臨床分離株進行PZA耐藥性測定，常規(guī)絕對濃度藥敏法檢測結果為敏

5、感35株，耐藥74株；PhaB法檢測結果為敏感34株，耐藥75株，與絕對濃度法檢測結果的符合率為91.7％，對兩種檢測方法不相符的9株菌株進行MIC測定，結果6株(3株敏感，3株耐藥)與PhaB法相符合，如以絕對濃度法測定PZA耐藥性結果為考核標準，則PhaB法檢測PZA耐藥性的敏感性為94.6％(70/74)、特異性為85.7％(30/35)、陽性預測值為93.3％(70/75)、陰性預測值為88.2％(30/34)、準確性為91.7

6、％(100/109)。與常規(guī)藥敏方法耗時長達6-8周相比，PhaB法檢測PZA耐藥性僅需2-3天，但與常規(guī)藥敏方法符合率高且實驗結果重復性好。對47株PZA耐藥菌株進行pncA基因測序，結果19株的pncA基因存在各種不同形式的突變，突變率達40.43％，在所有突變形式中，除已經(jīng)見報道的突變形式外，我們還發(fā)現(xiàn)了22個新的突變位點，這22種新的突變位點形成12種新的突變形式。 [結論]PhaB法檢測結核分枝桿菌PZA耐藥性具有快速

7、、操作簡便、與常規(guī)藥敏方法符合率較高等特點，且不需要特殊儀器設備，所用試劑也是一般常規(guī)試劑且價格低廉，可以作為PZA耐藥性快速檢測的篩選方法。所以本法具有重要的臨床檢測應用和推廣價值，特別適合于像我國這樣的結核病耐藥率高的發(fā)展中國家和經(jīng)濟落后的貧困國家和地區(qū)推廣應用。 本研究也證明，PZA耐藥相關基因pncA的突變是結核分枝桿菌對PZA產(chǎn)生耐藥的主要原因，更為重要的是我們發(fā)現(xiàn)了22種新的突變位點，這22種新的突變形成12種新的p