中國(guó)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥基因突變特征的初步研究.pdf

1、近年來(lái)，結(jié)核病的疫情呈現(xiàn)重新上升的趨勢(shì)。引起全球結(jié)核感染疫情回升的主要因素之一是耐藥結(jié)核分枝桿菌，尤其是耐多藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)及其引起疾病的流行。我國(guó)結(jié)核的耐藥情況尤為嚴(yán)峻，總耐藥率為27.8％，耐多藥率高達(dá)10.7％，由此而造成的結(jié)核病患病率和死亡率居高不下。因此，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性成為結(jié)核病防治工作的當(dāng)務(wù)之急，是制定恰當(dāng)?shù)幕煼桨傅闹匾罁?jù)。 異煙肼(Isoniazid，INH)是最有效的抗結(jié)核藥物之一。隨著

2、分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，異煙肼耐藥機(jī)制的逐步明了，現(xiàn)已證實(shí)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥主要與katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC等基因突變有關(guān)。 為了深入了解我國(guó)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥相關(guān)基因突變情況，明確其突變位點(diǎn)的分布、主要突變位點(diǎn)及其發(fā)生率，本研究從西藏、湖南、河南、四川、福建、安徽和陜西七省收集結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株，首先對(duì)其采用生化反應(yīng)方法進(jìn)行菌種鑒定并用比例法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，其后用聚合酶鏈反

3、應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC等基因，進(jìn)行DNA測(cè)序分析，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析基因突變類型及與耐藥之間的關(guān)系，并分析統(tǒng)計(jì)發(fā)生突變的各位點(diǎn)的突變率。 我們共收集到536株分枝桿菌臨床分離株，用鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行了菌種鑒定，89.93％為結(jié)核分枝桿菌，3.54％為牛分枝桿菌，6.16％為非結(jié)核分枝桿菌，0.37％為結(jié)核分枝桿菌加非結(jié)核分枝桿

4、菌的混合感染。 采用比例法對(duì)482株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)四種抗結(jié)核一線藥物(SM，RFP，INH，EMB)和一種二線藥物(PAS)全部敏感的菌株為118株，占全部被測(cè)菌株的24.48％；耐藥菌株364株，占全部被測(cè)菌株的75.52％，其中，單耐藥菌株88株，占18.26％；多耐藥菌株276株，占57.26％。 針對(duì)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的相關(guān)基因katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahp

5、C設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和DNA序列分析對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H<,37>Rv及291株臨床分離菌株，包括全敏感株64株，異煙肼相對(duì)敏感株48株，異煙肼單耐藥株30株，聯(lián)合耐藥株149株進(jìn)行耐藥基因突變檢測(cè)。 測(cè)序分析結(jié)果顯示：(1)179株異煙肼耐藥菌株中，163株發(fā)現(xiàn)耐藥基因“熱點(diǎn)突變區(qū)”突變，112株INH敏感株中有3株發(fā)生KatG基因的突變。與常規(guī)藥敏試驗(yàn)比例法比較，DNA測(cè)序法檢測(cè)的靈敏度為91.06％(163/17

6、9)，特異度為97.32％(109/112)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值98.19％(163/166)，陰性預(yù)測(cè)值87.20％(109/125)，符合度為93.47％(272/291)，兩種方法檢測(cè)的結(jié)果之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x<'2>=7.58，P>0.05)。(2)179株異煙肼耐藥菌株中，463位點(diǎn)發(fā)生突變的有129株，占72.07％，112株異煙肼敏感株中，463位點(diǎn)發(fā)生突變的有74株，占66.07％，耐藥株和敏感株間的突變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(x<'2>=1.1739，P>0.05)，證實(shí)INH耐藥與Arg463Leu突變無(wú)相關(guān)性。(3)在179株異煙肼耐藥菌株中，138株(77.09％)異煙肼耐藥株katG存在點(diǎn)突變，其中7個(gè)位點(diǎn)尚未見報(bào)道，131株(73.18％)耐藥株第315位點(diǎn)突變，涉及4種突變類型，但主要是AGC(Ser)→ACC(Thr)的突變，共123株，占這個(gè)位點(diǎn)突變的93.89％。未發(fā)現(xiàn)katG的缺失與插入。(4)1株(0.56％)耐藥株inhA發(fā)生突變，

8、敏感株中未檢測(cè)到突變。(5)18株(10.06％)耐藥株oxyR-ahpC基因連接區(qū)發(fā)生點(diǎn)突變，其中7株發(fā)生-9C→T的突變，占突變的3.39％，另有3株發(fā)生-5G→A的突變，3株發(fā)生-14C→T的突變等；敏感株中未檢測(cè)到突變。(6)3株(1.68％)耐藥株ndh存在點(diǎn)突變，突變類型為第191位點(diǎn)的GAG(Glu)→GGG(Gly)，敏感株中未檢測(cè)到突變。(7)檢測(cè)179株耐藥菌株的pre-inhA基因，-15C→T的突變有12株，占6

9、.67％，其中9株發(fā)生的是單點(diǎn)突變而沒(méi)有其他位點(diǎn)及其他相關(guān)基因突變，其他的突變還見于-19G→A、-8T→C、13G→C，敏感株中未檢測(cè)到突變。(8)在全部菌株中未發(fā)現(xiàn)oxyR和ahpC基因突變。(9)綜合本試驗(yàn)中各基因的變化情況，共有163株耐異煙肼菌株發(fā)生與異煙肼表型耐藥相關(guān)的突變。本項(xiàng)研究進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼與katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC基因突變之問(wèn)的關(guān)系，為下一步耐藥芯片的探針設(shè)計(jì)