實時PCR在結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變分子診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、結(jié)核病是全球范圍內(nèi)危害最為嚴(yán)重的慢性傳染病之一，在眾多結(jié)核治療藥物中，異煙肼作為一線藥物廣泛使用，導(dǎo)致耐異煙肼結(jié)核發(fā)生率高，危害面廣。本論文著重建立異煙肼耐藥突變檢測體系，并評價其應(yīng)用，為最終建立起適合臨床應(yīng)用的異煙肼耐藥突變檢測、指導(dǎo)其正確使用提供合適手段。論文內(nèi)容包括:耐藥結(jié)核病的流行和診治現(xiàn)狀評述（第一章）、實時PCR探針熔解曲線法檢測異煙肼耐藥突變體系的建立和分析性能評價（第二章）、上述體系的多中心臨床評價（第三章）、應(yīng)用上述技

2、術(shù)進(jìn)行的異煙肼耐藥突變流行病學(xué)調(diào)查（第四章）以及針對最常見katGS315T突變所建立的一種稀有突變定量體系（第五章），分述如下:
　　第一章緒論
　　首先概述了結(jié)核病的流行現(xiàn)狀、臨床診斷和治療方案，描述了結(jié)核菌的生物學(xué)背景，針對性地闡述了異煙肼的作用原理和結(jié)核異煙肼耐藥機制，總結(jié)了結(jié)核耐藥檢測尤其是耐異煙肼檢測的現(xiàn)狀及最新進(jìn)展，并介紹了本實驗室新近建立的探針熔解曲線分析(PMA)技術(shù)檢測突變的原理，最后提出了本論文的目的、

3、內(nèi)容及意義。
　　第二章異煙肼耐藥突變PMA檢測體系的建立和性能評價
　　已有研究證實的異煙肼耐藥突變相關(guān)區(qū)域包括katG315密碼子、inhA啟動子區(qū)、ahpC啟動子區(qū)和inhA94密碼子等四個區(qū)域，據(jù)此，我們建立了雙管雙色PMA檢測體系，采用自行建立的核酸提取方法，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件，該體系的檢測限為3拷貝/反應(yīng)。所有突變位點的熔點值(Tm)與對應(yīng)的野生型相差在2℃以上，均可實現(xiàn)有效檢出，標(biāo)準(zhǔn)盤的檢測特異性達(dá)100％。檢

4、測5種常見突變的Tm值標(biāo)準(zhǔn)偏差SD＜1℃(n=6)，最低不均一耐藥檢測水平為30％（熔解速率設(shè)為1℃/步）。對中國食品藥品檢定研究院的非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的檢測結(jié)果表明，46株NTM在四個檢測通道均未出現(xiàn)非特異信號。該體系可在三種不同機型的儀器上使用，結(jié)果無顯著差異。
　　第三章PMA體系的多中心驗證
　　利用北京、河南和深圳三家醫(yī)院提供的1096株結(jié)核臨床分離株，對PMA異煙肼耐藥突變檢測體系進(jìn)行了多中心雙盲驗證。對照

5、方法為比例法藥敏試驗，驗證方法采用測序法。結(jié)果表明，與比例法藥敏試驗體系相比，PMA的臨床靈敏度為90.8％(397/437)，臨床特異性為96.4％(635/659)。測序結(jié)果表明，PMA檢出的所有突變型均發(fā)生了突變（涉及397株耐藥株和24株敏感株）;在40株P(guān)MA檢測無突變的異煙肼耐藥株中，測序結(jié)果表明，4株為不均一耐藥突變，5株發(fā)生了PMA檢測區(qū)外突變，而另外31株均未檢測到突變。測序結(jié)果表明，在異煙肼耐藥株中，PMA共檢測出2

6、3種突變類型。最常見的四種突變是katGS315TAGC→ACC、inhA啟動子-15C→T、katGS315NAGC→AAC和ahpC啟動子-10C→T突變，占異煙肼耐藥株的87.4％(382/437)，未檢出inhA94位點突變。PMA檢出76.5％(13/17)的不均一耐藥株。因此，PMA與培養(yǎng)法藥敏試驗一致性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適合臨床應(yīng)用。
　　第四章廈門和漳州兩地異煙肼耐藥的流行病學(xué)分析
　　2006年6月至2009年

7、12月，從廈門和漳州地區(qū)收集785份TB臨床分離株，2008年10月至2009年12月收集146份涂陽痰標(biāo)本，利用PMA對上述標(biāo)本進(jìn)行異煙肼耐藥突變檢測，突變陽性的標(biāo)本測序驗證以確定具體突變類型。對最終納入分析的833例病人的910份標(biāo)本的檢測結(jié)果表明，廈門和漳州兩地的異煙肼耐藥突變率合計為19.4％(162/833)，與我國18.96％的異煙肼耐藥率接近，而高于全球13.9％的異煙肼耐藥率;在所檢出的14種異煙肼耐藥突變中，katGS

8、315T(AGC→ACC)突變占48％（77/162，含72份單獨突變和5份合并突變），inhA啟動子-15C→T突變占30％（48/162，含41份單獨突變和7份合并突變），katGS315N(AGC→AAC)突變占8％（13/162，含11份單獨突變和2份合并突變），三種類型突變合計占85％(138/162)，是典型的優(yōu)勢突變，與國內(nèi)外報道一致。其中排在第一位的katGS315T突變與高水平耐藥、耐多藥和廣泛耐藥密切相關(guān)，提示廈漳兩

9、地有9.2％(77/833)患者可能需要采用二線藥物治療，而處于第二位的inhA啟動子-15C→T突變與低水平耐異煙肼相關(guān)，且同時耐受乙硫異煙胺和丙硫異煙胺，這部分患者(5.8％，48/833)可采用高劑量異煙肼治療，但不適用含二線藥乙硫異煙胺和丙硫異煙胺的治療方案。因此，上述流行病學(xué)研究結(jié)果不僅有助于了解本地結(jié)核耐藥情況，以便采取相應(yīng)的防控措施，而且還為臨床醫(yī)生的合理用藥提供了參考依據(jù)。
　　第五章實時PAP定量檢測結(jié)核異煙肼耐

10、藥突變
　　實時追蹤耐藥突變的發(fā)生與變化對于指導(dǎo)臨床治療無疑具有重要意義，耐藥突變的發(fā)生起初含量極低，而其不斷累積的過程又必須通過定量檢測才能實現(xiàn)，為此，需要發(fā)展一種能夠選擇性定量檢測突變的技術(shù)。焦磷酸水解激活的聚合反應(yīng)（Pyrophosphorolysis-activatedpolymerization，PAP）是一種特異檢測稀有突變的方法。我們借鑒實時PCR模式，將其發(fā)展為實時PAP，用之于定量檢測耐異煙肼TB中最常見的kat

11、GS315T(AGC→ACC)突變。利用染料法，分別建立了野生型和突變型兩個實時PAP檢測體系。采用質(zhì)粒模板，兩個實時PAP體系的檢測限均為10拷貝/反應(yīng)，特異性分別為5×105拷貝/反應(yīng)和5×104拷貝/反應(yīng)，選擇性均為105∶1。對71份臨床涂陽痰標(biāo)本進(jìn)行實時PAP檢測，并以測序和實時PCR檢測為對照。結(jié)果表明，其中的64份標(biāo)本，3種方法檢測結(jié)果完全一致。在7份不一致的標(biāo)本中，6份的實時PAP檢出結(jié)果是存在不同含量的突變，即發(fā)生不同