滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB單堿基突變的應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分、HRCA技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變
　　目的:建立一種快速準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)簡便的檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴(kuò)增(hyper-branched rolling circleamplification，HRCA)技術(shù)。
　　方法:
　　1.通過查閱文獻(xiàn)并進(jìn)行臨床調(diào)查，確立結(jié)核分枝桿菌rpoB基因531位點絲氨酸突變(C-T)的檢測目標(biāo)。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rpoB基

2、因標(biāo)準(zhǔn)序列信息（從NCBI中獲得），設(shè)計檢測該基因突變位點的鎖式探針以及用于臨床標(biāo)本耐藥基因rpoB基因的PCR擴(kuò)增引物。
　　2.建立并優(yōu)化檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因單堿基突變的支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，包括:鎖式探針與模板連接環(huán)化溫度，連接環(huán)化時間;滾環(huán)擴(kuò)增最適溫度、擴(kuò)增時間。
　　3.通過對人工合成的野生型靶序列、突變型靶序列、其他非相關(guān)基因序列以及不加靶序列的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，討論該方法的特異性和靈敏度。
　　4.采

3、用支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，驗證該檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。
　　結(jié)果:
　　1.鎖式探針與相應(yīng)模板65℃連接1h可保證檢測的特異性。37℃滾環(huán)擴(kuò)增1h，能夠得到明顯的擴(kuò)增結(jié)果，且通過對不同濃度突變型靶序列樣本的檢測，采用該技術(shù)最低能檢測出樣本中含有1％的突變株。
　　2.利用支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)分別檢測了臨床結(jié)核桿菌利福平耐藥株、利福平敏感株以及結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv。檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。
　　結(jié)

4、論:我們建立的用于檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變的支鏈滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性高、靈敏度高、簡單易操作的優(yōu)點。本檢測方法與傳統(tǒng)方法相比，大大縮短了檢測時間，而且不需特殊儀器和試劑，大大降低了檢測成本。
　　第二部分、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合DNA芯片檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變
　　目的:將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與DNA芯片技術(shù)相結(jié)合，建立一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變的芯片技術(shù)。
　　方法:
　　1.以結(jié)核分枝桿菌r

5、poB基因為研究對象，選擇531位點的絲氨酸突變(C-T)作為檢測目標(biāo)，根據(jù)鎖式探針與模板結(jié)合區(qū)外的序列設(shè)計通用寡核苷酸探針，作為捕獲探針，用于包被醛基玻片。
　　2.通過檢測人工合成的野生型和突變型靶序列，證明所設(shè)計寡核苷酸探針的準(zhǔn)確性及本檢測方法的可靠性，并優(yōu)化該方法的反應(yīng)條件，同時討論其特異性和靈敏度。
　　3.利用本方法對臨床樣本進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果與樣本測序結(jié)果比對，從而驗證本方法的準(zhǔn)確性及臨床應(yīng)用價值。

6、　　結(jié)果:
　　1.將設(shè)計好的捕獲探針點于醛基片上預(yù)先設(shè)計好的點樣點，對人工合成靶序列進(jìn)行檢測。相應(yīng)突變型位點和陽性對照位點均有明顯顯影結(jié)果，背景清晰，陰性對照位點及其他點樣點均無顯影結(jié)果。證明設(shè)計的探針合理可靠，本檢測方法特異性好且準(zhǔn)確可靠。
　　2.通過對不同濃度突變型靶序列樣本的檢測，研究發(fā)現(xiàn)該方法最低可檢測出含有5fmol/L突變型靶序列的樣本。
　　3.采用本方法對臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，陽性對照與突變型