結核分枝桿菌利福平耐藥相關基因突變檢測及Rv2629基因191A-C突變功能初步研究.pdf

1、結核病是人類世界古老的細菌性傳染病。目前，全世界60億人口中，近1/3(約18億)感染結核分枝桿菌。根據WHO統(tǒng)計，每年新發(fā)病人達800～1000萬，每年因結核病死亡者達200余萬，98％的結核病死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。作為有著巨大人口壓力的發(fā)展中國家，中國的結核病負擔也相當嚴重。 近三十年來，結核分枝桿菌與HIV的共感染，以及多耐藥結核分枝桿菌的出現改變了結核的流行病學模式，尤其是近期在非洲大陸發(fā)現極端耐藥結核分枝桿菌，該類病原

2、菌耐受包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和鏈霉素等在內的所有一線藥，并表現出對6種二線治療藥物中的至少3種耐藥。到目前為止，極端耐藥性結核分枝桿菌已在全球包括8個歐洲國家在內的28個國家傳播，而極端耐藥性結核患者數量約為2.7萬例，因此而死亡的患者數已逾1.6萬例。這些數據使得全部極端耐藥性結核感染患者的死亡率超過了50％，甚至在某種程度上高過了艾滋病感染的致死率。另據一項調查表明，艾滋病患者更容易受到“極端耐藥結核菌”的感染而死亡

3、。目前所有可用的抗結核藥物都無法治療這種結核病，一旦傳播開來，人類將面臨重大災難。研究結核分枝桿菌的耐藥機制，對開發(fā)新型藥靶，研制快速、簡便的檢測方法意義重大。 利福平是治療結核病的重要一線藥物，超過95％的利福平抗性的產生是由于編碼RNA聚合酶β-亞單位基因中(rpoB)81對堿基突變造成，但3％～10％的利福平耐藥菌株的rpoB基因未檢測到突變，說明結核分枝桿菌存在其它的利福平抗性機制。90％以上耐利福平菌株也抗異煙肼，所以

4、利福平抗性也是多耐藥結核的一個潛在標志。 為了檢測利福平耐藥株中的耐藥因子，我們采用蛋白質組學的技術手段，對結核分枝桿菌H37Rv和臨床耐藥菌株的菌體蛋白進行比較分析，對差異蛋白點進行質譜分析和數據庫檢索鑒定，繼而對蛋白的編碼基因克隆測序。一共有9個差異蛋白被鑒定出來，它們是Rv0054、Rv0927c、Rv1446c、Rv2145c、Rv2629、Rv2334、Rv3J33c、Rv3136和Rv3841。通過設計特異性引物PC

5、R擴增18株臨床利福平耐藥菌株、15株藥物敏感菌株和實驗室標準株H37Rv的對應片段，進行DNA測序。結果顯示：Rv0054、Rv3133c、Rv2145、Rv3136c和Rv2334等5個基因的核苷酸序列在所有菌株中沒有發(fā)生突變。Rv0927c基因402—422位堿基的GCA缺失，導致編碼的140位絲氨酸(SER)缺失；Rv1446c基因575位堿基的GMP殘基突變?yōu)镃MP，導致編碼的氨基酸由精氨酸(ARG)突變?yōu)楦彼?PRO)；R

6、v3841基因468位堿基的AMP殘基突變?yōu)镚MP，但編碼的156位氨基酸仍然保持為亮氨酸(LEU)。這些基因突變位點同利福平耐藥的關聯度不高，可能是菌株地域多態(tài)性在基因水平的顯示，可以作為流行病調查時參考的分子指標。而Rv2629基因中發(fā)現了191 A/C突變，導致64ASP變?yōu)?4ALA。這種突變存在于112株臨床利福平耐藥菌株中的111株，突變率達99.1％;然而在30株臨床藥物敏感菌株中未發(fā)現。進一步將Rv2629基因的野生型和

7、突變型轉入利福平敏感的恥垢分枝桿菌，藥敏實驗證實Rv2629基因在191位點的突變可以增強受體菌的耐藥性，而野生型基因不能賦予重組菌株藥物耐受性。同時對該蛋白進行了體外表達，通過質譜技術測定了野生型重組蛋白和突變蛋白的分子量分別為46268.4Da和46231.5Da。利用制備的兔源多抗血清，對該蛋白在H37Rv菌體的分布進行了亞細胞定位，Western Blot結果顯示蛋白主要位于細胞膜和細胞壁。對不同菌株中基因的mRNA轉錄水平進行