改進(jìn)的校讀——PCR技術(shù)的建立及其在結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥檢測中的應(yīng)用.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃的完成，在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了大量的微妙差異即多態(tài)性，而單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是其中最廣泛最大量的類型。截止目前，公共數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的SNPs數(shù)量已經(jīng)超過了九百萬。簡便、快速、準(zhǔn)確有效且成本低的單核苷酸多態(tài)性和突變檢測技術(shù)對于許多遺傳疾病的早期診斷和預(yù)防、高危群體的發(fā)現(xiàn)、耐藥基因的鑒定等方面具有重要的作用。1998年美國辛辛那提大學(xué)的Wanli Bi和Peter J.Stambrook首次將校讀PCR(Proofrea

2、ding PCR，PR-PCR)技術(shù)用于已知點(diǎn)突變的檢測，但是由于該技術(shù)對等位基因的區(qū)分效率較低，無法有效地用于點(diǎn)突變和SNPs檢測，因此沒有得到廣泛地應(yīng)用和推廣。在本研究中我們建立了一種改進(jìn)的PR-PCR技術(shù)，該檢測技術(shù)使用了3'-末端ddNTP封閉的引物和高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶的混合酶。其中ddNTP-封閉的引物具有最佳的封閉效果能夠避免引物的非特異性延伸，而將高保真DNA聚合酶與非高保真DNA聚合酶以適當(dāng)比例(0

3、.1-0.15U∶1U)混合使用，高保真DNA聚合酶的使用量極少，主要發(fā)揮其校對功能:選擇性地切除與模板不匹配的3'羥基被封閉的核苷，暴露出正常的3'羥基;而非高保真DNA聚合酶的使用量較多，主要發(fā)揮聚合酶作用進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，混合酶的使用顯著提高了SNPs或點(diǎn)突變檢測的靈敏度、特異性及準(zhǔn)確性。
　　本研究證明改進(jìn)的PR-PCR技術(shù)能夠檢測多種突變類型，包括:點(diǎn)突變、SNPs、插入與缺失突變（insertions/deletio

4、ns，indels）甚至能夠檢測出封閉引物3'末端倒數(shù)1-8位內(nèi)的任一突變位點(diǎn)，大大起高了該檢測技術(shù)的靈活性和應(yīng)用范圍。此外，該方法能夠從野生型DNA中檢測出突變率僅為5×10-5的突變體，存在著高度的選擇性和特異性;還能夠檢測出500拷貝的突變型模板顯示出了極高的靈敏度。該技術(shù)還能夠結(jié)合探針、熒光染料等實(shí)現(xiàn)多種突變類型的閉管熒光檢測，擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。
　　為進(jìn)一步評估改進(jìn)的PR-PCR方法的準(zhǔn)確性、有效性及可行性，我們對39份

5、樣品中結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變率最高的四個突變位點(diǎn):531位絲氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)、526位組氨酸(His)→酪氨酸(Tyr)、526位組氨酸(His)→精氨酸(Arg)和516位天冬氨酸(Asp)→纈氨酸(Val)進(jìn)行了點(diǎn)突變檢測，并隨機(jī)挑選出幾個樣品同時進(jìn)行Sanger測序及454高通量測序，結(jié)果表明本研究建立的改進(jìn)的PR-PCR方法的檢測結(jié)果與454高通量測序結(jié)果一致，能夠檢測出突變率僅為0.185％的樣品，表明改進(jìn)