分子信標(biāo)熒光定量PCR快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌技術(shù)及產(chǎn)品的開(kāi)發(fā).pdf

1、目的:建立分子信標(biāo)熒光定量PCR快速檢測(cè)結(jié)核桿菌方法，為臨床結(jié)核病的診斷提供特異性強(qiáng)、靈敏度高、可標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化的檢測(cè)方法；評(píng)價(jià)分子信標(biāo)熒光定量PCR法在檢測(cè)臨床標(biāo)本中的應(yīng)用價(jià)值；評(píng)估分子信標(biāo)熒光定量PCR法用于監(jiān)控抗結(jié)核治療的可行性：應(yīng)用所建立方法開(kāi)發(fā)檢測(cè)試劑盒。 方法: 1．分子信標(biāo)與引物的設(shè)計(jì)與合成查閱文獻(xiàn)，選擇適合結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)的靶基因。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢靶基因序列，找出高度保守的區(qū)段。遵循分子

2、信標(biāo)與引物設(shè)計(jì)的規(guī)則，設(shè)計(jì)探針與引物并提交公司合成。對(duì)新合成的探針與引物進(jìn)行篩選與反應(yīng)性確認(rèn)。選擇結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的最佳提取方法。 2．分子信標(biāo)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方法的建立與評(píng)價(jià) 1)分別優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)的退火溫度、Mg<'2+>濃度、Taq DNA聚合酶用量、PCR Buffer濃度、循環(huán)參數(shù)等條件，建立熒光定量PCR方法。 2)方法評(píng)價(jià) 特異性：用已建立方法分別檢測(cè)10株標(biāo)準(zhǔn)菌株與150株

3、臨床分離結(jié)核分枝桿菌。 靈敏度：以結(jié)核分枝桿菌H37Ra為試驗(yàn)菌株，對(duì)模板DNA 10倍梯度稀釋，分析方法的最低檢出拷貝數(shù)。 抗干擾性：接種2支菌量相當(dāng)(約10<'5>cfu)的結(jié)核分枝桿菌，其中一支加入菌量遠(yuǎn)大于結(jié)核分枝桿菌的其他雜菌，提取模板DNA分別用已建立方法檢測(cè)。 重復(fù)性：用已建立方法重復(fù)3次測(cè)定同一濃度的模板DNA。 3．分子信標(biāo)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方法的應(yīng)用與產(chǎn)品開(kāi)發(fā) 評(píng)估采集臨床疑似結(jié)