檢測海、鳥、堪薩斯、偶發(fā)分枝桿菌四重?zé)晒舛縋CR的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建檢測海、鳥、堪薩斯、偶發(fā)分枝桿菌的四重?zé)晒舛縋CR，探討熒光定量PCR技術(shù)檢測非結(jié)核分枝桿菌（NTM）的優(yōu)缺點，為NTM感染的診斷提供更加簡便、可靠的實驗室方法。
　　方法：通過總結(jié)前期研究成果和檢索現(xiàn)有文獻(xiàn)，分別查找擴(kuò)增海分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌四種感染手部常見NTM基因序列的特異引物和通用引物。首先用通用引物PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)菌DNA后測序，測序結(jié)果用GeneBank數(shù)據(jù)庫比對以驗證標(biāo)準(zhǔn)菌符合

2、要求；其次用普通PCR驗證多重特異引物的特異性；然后用特異引物構(gòu)建四重?zé)晒舛縋CR，分別檢測以上四種標(biāo)準(zhǔn)菌DNA，評估熒光定量PCR的特異性及敏感性；最后用該四重?zé)晒舛縋CR檢測16份海、鳥、堪薩斯、偶發(fā)分枝桿菌感染的標(biāo)本。
　　結(jié)果：1、查找到4對分別擴(kuò)增海、鳥、堪薩斯、偶發(fā)分枝桿菌基因序列的特異引物及1對特異擴(kuò)增NTM基因序列的通用引物；2、構(gòu)建了能檢測海、鳥、堪薩斯、偶發(fā)分枝桿菌四種感染手部常見NTM的熒光定量PCR方法

3、；3、該熒光定量PCR可檢測NTM的DNA濃度為5.2fg/μl，低于普通PCR最低檢測濃度（52fg/μl）；4、該四重FQ-PCR檢測16份臨床標(biāo)本，11份標(biāo)本結(jié)果為陽性，其中海分枝桿菌4份，鳥分枝桿菌3份，堪薩斯分枝桿菌2份，偶發(fā)分枝桿菌2份，經(jīng)多重普通PCR檢測，無標(biāo)本出現(xiàn)兩種以上NTM的感染；5、該四重?zé)晒舛縋CR檢測NTM所需時間約為3小時。
　　結(jié)論：本研究建立的FQ-PCR能檢測海分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝