巢式實時熒光定量PCR檢測結(jié)核分枝桿菌DNA方法的建立及在結(jié)核性胸膜炎的臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　1、巢式實時熒光定量聚合酶連反應(yīng)(Quantitative Nested Real-Time Polymerase Chain Reaction，QNRT-PCR)檢測結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB) DNA方法的建立。
　　2、評價QNRT-PCR檢測MTB DNA的應(yīng)用及其在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價值。
　　方法:
　　1、制備結(jié)核分枝桿菌MPT64基因熒光

2、定量標(biāo)準(zhǔn)品
　　以H37vRV標(biāo)準(zhǔn)菌株MPT64基因為模板，在引物（IF-1和IR-2，具體序列詳見第一部分第一節(jié)引物的設(shè)計合成）引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物割膠回收、純化后與pGM-T載體連接，經(jīng)過克隆、轉(zhuǎn)化、篩選及測序鑒定，確定目的質(zhì)粒，根據(jù)公式:質(zhì)?？截悢?shù)濃度（拷貝/ml）=（質(zhì)量÷分子量）×6.02×1023，利用紫外分光光度計計算出質(zhì)?？截悵舛?，10倍倍比稀釋后作為檢測MTB DNA的陽性參照定量標(biāo)準(zhǔn)品。
　

3、　2、建立巢式PCR(nested PCR，nPCR)檢測結(jié)核分枝桿菌DNA的方法
　　根據(jù)MTB基因的穩(wěn)定性和特異性，設(shè)計擴(kuò)增MPT64基因序列的內(nèi)外套引物（外套引物分別為EF-1、ER-2，內(nèi)套引物分別為IF-1、IR-2，具體序列詳見第一部分第一節(jié)引物的設(shè)計合成），應(yīng)用nPCR兩步法，分別擴(kuò)增DNA片段大小為241bp和201bp的內(nèi)外片段，2％的瓊脂糖凝膠電泳，然后采用核酸蛋白成像儀拍照對圖片進(jìn)行定性分析。
　　3、

4、建立實時定量PCR(Real-time PCR)檢測結(jié)核分枝桿菌DNA的方法
　　以IF-1和IR-2為引物，結(jié)核分枝桿菌MPT64基因序列為模板，以上述“1”構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性參照，采用SYBR GreenⅠ熒光染料法對PCR擴(kuò)增過程進(jìn)行標(biāo)記，LightCyler3.5 real-time PCR system進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測分析，目的片段為201bp。
　　4、建立QNRT-PCR檢測MTB DNA方法
　　胸水是

5、一種含結(jié)核分枝桿菌微量的樣本，為了提高PCR檢測這類樣本中MTB DNA的敏感性和特異性，同時能夠準(zhǔn)確定量，我們將nPCR和real-time PCR兩種方法進(jìn)行合并創(chuàng)新，在巢式PCR第二步應(yīng)用SYBRGreenⅠ熒光染料法，以上述“1”構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性參照，建立檢測結(jié)核分枝桿菌MPT64基因的QNRT-PCR方法。
　　5、比較三種PCR檢測痰液和胸水中MTB DNA的結(jié)果
　　我們將來自肺結(jié)核患者痰液24份，結(jié)核性

6、胸膜炎患者胸水27份，以及對照組75份痰和胸水同時進(jìn)行了上述三種PCR方法的檢測和比較。
　　6、分別對27例結(jié)核性胸膜炎患者的炎性指標(biāo)、免疫指標(biāo)、胸水量等與巢式實時熒光定量PCR結(jié)果及五種病原學(xué)檢測方法之間進(jìn)行了相關(guān)性分析法
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用測定的重組質(zhì)粒序列與GeneBank中的MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的MPT64基因序列進(jìn)行比較，同源性100％。將7.09×1012拷貝/ml質(zhì)粒倍比稀釋

7、后取7.09×102-7.09×109copy/ul的8個梯度，得到該方法在104-108拷貝/ml范圍內(nèi)，隨著起始模板量的減少，對應(yīng)的Ct值相應(yīng)增大，二者呈線性關(guān)系，r=0.99，且溶解曲線呈單峰。
　　2、以痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性為肺結(jié)核確診標(biāo)準(zhǔn)，檢測24份來自肺結(jié)核病人的痰MTB DNA，結(jié)果巢式實時熒光定量PCR方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為95.83％、61.54％、69.70％、和94.12％;以內(nèi)

8、科胸腔鏡胸膜活檢的組織病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性和特異性分別為75％和100％; QNRT-PCR、real-time PCR、nPCR三種方法檢測結(jié)果比較陽性率差異顯著(P＜0.05)，QNRT-PCR的敏感性最高;兩種定量PCR檢測結(jié)果比較，QNRT-PCR的Ct值較小。
　　3、進(jìn)一步將QNRT-PCR用于胸水中MTB DNA的檢測，結(jié)果，對來自結(jié)核性胸膜炎患者的27份胸水樣本中，該方法陽性率70.37％，而real-ti

9、me PCR及nPCR的陽性率分別為66.67％及11.11％。
　　4、通過對QNRT-PCR方法檢測結(jié)核性胸膜炎患者胸水樣本中MTBDNA量與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析得出:胸水中MTB DNA量與ESR、AFB、培養(yǎng)、nPCR、T-SPOT、PPD指標(biāo)具有正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與其他指標(biāo)無明顯正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究建立了QNRT-PCR檢測MTB DNA方法，并證實該方法具有很高的敏感性，且特異性較