利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺開發(fā)檢測結(jié)核分枝桿菌試劑.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(簡稱結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核菌)引起的慢性感染性疾病，由于僅有10％左右的結(jié)核菌患者會發(fā)展成活動性結(jié)核病，90%的患者為潛伏性結(jié)核菌患者，發(fā)展出能檢測出潛伏性結(jié)核菌患者的方法，更為迫切，及早的治療好患者隱藏的病患，是對患者負(fù)責(zé)，也是對患者的家人和全社會負(fù)責(zé)。
　　本研究完成檢測結(jié)核分枝桿菌試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）的研制和開發(fā)，試劑盒各項(xiàng)性能指標(biāo)符合要求，經(jīng)過臨床符合性評價，可用于檢測患者的潛伏性結(jié)核和活動

2、性結(jié)核的診斷。
　　研究方法：
　　1.制備γ-干擾素（IFN-γ）的單克隆抗體，篩選出反應(yīng)性最高，靈敏度、特異性最好的抗體配對，同時篩選出適合用于包被的單克隆抗體和適合用于標(biāo)記的單克隆抗體。
　　2、針對包被抗體，篩選出反應(yīng)性最佳、經(jīng)37℃10天破壞，反應(yīng)性保持穩(wěn)定的磁微粒包被方法、活化方法及保護(hù)蛋白種類，使γ-干擾素（IFN-γ）單克隆抗體與載體磁微粒能夠緊密的連接。
　　3、針對標(biāo)記抗體，建立反應(yīng)性最佳，經(jīng)

3、37℃10天破壞，反應(yīng)性保持穩(wěn)定的酶結(jié)合物稀釋液緩沖體系和保護(hù)蛋白種類，實(shí)現(xiàn)檢測信號的放大。
　　4、在2、3步驟基礎(chǔ)上，評價開發(fā)試劑的相關(guān)性能，實(shí)現(xiàn)患者結(jié)核分枝桿菌的快速檢測。
　　研究結(jié)論：
　　1、針對制備的γ-干擾素單克隆抗體結(jié)果表明，篩選出了14株能夠分泌γ-干擾素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)、擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)適量的雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠的腹腔中，獲取腹水，經(jīng)蛋白純化后獲得單克隆抗體。將這14個單克隆抗體

4、經(jīng)包被和辣根過氧化物酶標(biāo)記后選出最優(yōu)的配對組合即1＃包被抗體與3＃酶標(biāo)抗體。
　　2、磁微粒包被方法的結(jié)果是羧基兩步法，活化時間1h±5min，包被抗體濃度0.1ug/人份，包被時間1h±5min，封閉液為pH7.40.02M PBS+1%的casein+1‰的ADP+2‰的PC-300。后經(jīng)過37℃10天的破壞性考核，與4℃條件下反應(yīng)性基本一致。
　　3、酶結(jié)合物的確定結(jié)果顯示不同緩沖液的差別不大，但不同蛋白影響較大，從緩

5、沖液角度對比，不論哪種蛋白，8＃配方的穩(wěn)定效果較好，經(jīng)過37℃10天的穩(wěn)定性放置，8＃配方穩(wěn)定性最好，因此選擇8＃配方為最終酶結(jié)合物稀釋液的配方。
　　4、校準(zhǔn)品稀釋液確定結(jié)果顯示1＃校準(zhǔn)品稀釋液配方在反應(yīng)性、凍干前后穩(wěn)定性、融解后穩(wěn)定性和37℃10天的熱穩(wěn)定性方面均能保持很好的性能，因此選擇1＃校準(zhǔn)品稀釋液配方。
　　5、反應(yīng)體系的確定結(jié)果為37℃反應(yīng)30min，雙抗體夾心一步法。
　　6、本臨床研究共檢測結(jié)核病患者

6、樣本260例，研究試劑檢出215例陽性，靈敏度為82.69%；119例非結(jié)核性肺部疾病患者和其他患者樣本共檢出陰性99例，特異性為83.19%。研究試劑與參比試劑的陰性符合率為90.20%（95%CI：87.44%~93.52%）；陽性符合率為91.07%（95%CI：88.10%~94.01%）；總符合率為90.77%（95%CI：87.79%~93.78%）。通過對臨床病人的全血進(jìn)行刺激和分析，該研究的針對結(jié)核病患者靈敏度已達(dá)到82