丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒（磁微粒化學發(fā)光法）的開發(fā)與應用.pdf

1、丙型肝炎病毒感染已成為全球所面臨的衛(wèi)生難題之一。因此，在醫(yī)學上丙型肝炎的臨床檢測對患者非常重要。臨床上常以丙型肝炎病毒抗體作為診斷依據(jù)，常用的檢測手段有酶聯(lián)免疫吸附試驗法、化學發(fā)光免疫法、膠體金免疫層析試驗法。而這些技術手段存在著檢測時間長、靈敏度低、特異性差等缺點，因此，研發(fā)一種能夠提高HCV檢測靈敏度和特異性、縮短檢測時間的體外診斷試劑迫在眉睫。在體外診斷領域，利用磁性復合微粒的特點并將其和化學發(fā)光免疫法結合起來，開發(fā)出一種高靈敏度

2、和特異性，操作簡便快速的HCV抗體檢測學手段對HCV檢測是一種創(chuàng)新性的突破。
　　本論文研究的內容主要包括：（1）試劑盒原材料的篩選；（2）生產(chǎn)工藝與反應體系的研究；（3）試劑盒質控品及企業(yè)內控品的制備；（4）參考值（范圍）的確定；（5）試劑盒穩(wěn)定性的研究；（6）試劑盒分析性能的評估。
　　主要的研究結果如下：
　?。?）在原材料篩選方面，我們通過配對實驗最終確定了伊美諾公司的產(chǎn)品作為本試劑盒的包被抗原和標記抗體。

3、r>　?。?）在生產(chǎn)工藝方面，我們最終篩選出氨基磁珠作為固相載體，并采用氨基兩步法進行包被；活化和包被緩沖液為B液；活化時間為1h；包被時間為1h；包被濃度0.7μl/人份；封閉液主要組分為 Tris-HCl（pH7.4）和2％的Casein；酶濃度為1/2000，酶稀釋液主要組分為PBS和3%BSA；樣品稀釋液為PBS和1‰Casein。陰陽性對照稀釋液為含Casein的Tris-Hcl緩沖液。
　　（3）在反應體系方面，加樣模

4、式為10μl樣本-20μl磁微粒-100μl樣稀，加酶100μl；37℃反應，反應模式為15min+17min；加入底物混勻后1-5min測定。
　?。?）結合國家參考品的設置和本試劑的特點，我們建立了一套企業(yè)內控品，共有67份，主要包括30份陰性參比品、30份陽性參比品、6份靈敏度參比品和1份精密性參比品。
　?。?）通過用本試劑盒對592份丙肝患者陽性樣本和3480例健康人陰性樣本檢測所得的OD進行相關分析，我們確定cu

5、t off值＝0.4*PC均值。
　　（6）在試劑穩(wěn)定性方面，通過對三批成品試劑進行加速、拆分、實時穩(wěn)定性考核，最終確定該產(chǎn)品的有效期為12個月以上（2～8℃儲存），各組分拆封后至少可以使用30天。
　　（7）經(jīng)過對三批成品試劑進行分析性能評估，我們得到以下結論：三批產(chǎn)品對企業(yè)內控品的陰性符合率、陽性符合率、靈敏度、變異均符合要求，且不同規(guī)格、不同機型檢測結果沒有明顯區(qū)別；不同抗凝劑（EDTA-2Na或K、枸櫞酸鈉、肝素）對

6、檢測結果無顯著影響，可以滿足臨床對血清/血漿樣本檢測的需要；其它抗體以及內源性干擾物質等對檢測結果無顯著影響；試劑機載穩(wěn)定性：可穩(wěn)定放置28天；AutoLumoA2000 Cutoff值有效期：28天；該產(chǎn)品與RIBA的檢測一致率較高；該產(chǎn)品符合HCV抗體國家參考品考核要求；本試劑盒對Seracare BBI血清轉換盤的檢測能力與國際知名廠家HCV抗體檢測試劑盒ORTHO?3.03.0 ELISA及ORTHO3.0 EnhancedSA