A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體間接ELISA檢測試劑盒的開發(fā).pdf

1、口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth diseasevirus，F(xiàn)MDV）引起的高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄動物產(chǎn)生急性高熱等癥狀。該病感染能力強，傳播途徑多，在多個國家和地區(qū)發(fā)生過大流行，嚴重阻礙了畜牧業(yè)發(fā)展。口蹄疫病毒有7個血清型，分別為O、A、C、Asia1、SAT1-3型，每個血清型又包含多個亞型，各型之間不存在交叉反應(yīng)。我國的主要流行血清型為A型、O型和A

2、sia1型。2009至2013年間，在我國上海、湖北、武漢、新疆阿克蘇地區(qū)以及周邊國家多次爆發(fā)A型口蹄疫疫情，給當?shù)亟?jīng)濟帶來了巨大的損失。
　　為建立一種有效檢測A型FMD的方法，首先需獲得具有活性的A型FMDV VP1蛋白。經(jīng)過PCR擴增得到A型FMDV vp1基因片段，與原核表達載體pET-28a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-A-vp1。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達含重組質(zhì)粒pET-A-vp1的E. coliBL21（DE3）菌后，SDS-

3、PAGE及Western-Blot分析表明，A-VP1重組蛋白分子質(zhì)量約為29 ku，能夠被A型口蹄疫陽性血清特異性識別，蛋白表達正確。超聲破碎后發(fā)現(xiàn)A-VP1蛋白以包涵體形式存在。通過對表達條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在37℃條件下，OD600為0.6，IPTG終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)表達6 h后，A-VP1蛋白的表達量最大。ELISA檢測結(jié)果顯示A-VP1包涵體蛋白經(jīng)過洗滌純化，尿素濃度梯度透析復(fù)性后活性較高。A型FMDV VP1活

4、性蛋白的成功表達為進一步研制口蹄疫基因工程疫苗和診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
　　以原核表達經(jīng)純化復(fù)性制備的A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白代替?zhèn)鹘y(tǒng)病毒抗原包被，建立快速、安全、有效的A型FMDV抗體ELISA檢測試劑盒。對前期制備的A-VP1蛋白進行Western-Blot檢測，結(jié)果表明，A-VP1蛋白能夠特異性識別A型FMDV陽性牛血清，可作為檢測抗原建立檢測A型FMDV抗體檢測的方法。以最佳質(zhì)量濃度1 mg/LA-VP1蛋白為

5、檢測抗原，方陣滴定法確定最佳檢測血清稀釋度為1:100，最佳的酶標二抗稀釋度為l:2000，建立A型FMDV抗體ELISA檢測方法。該方法的敏感性為94.32％，特異性為99.09％，批內(nèi)與批間重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于10%。采用該方法檢測201份臨床血清，與液相阻斷ELISA試劑盒的符合率達92.54%。以此為基礎(chǔ)組裝A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體間接 ELISA檢測試劑盒，該試劑盒特異、敏感、穩(wěn)定、操作簡便，可用來監(jiān)控 A型口蹄疫抗體水