豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）是最小的一種動(dòng)物病毒，含有ORF1和ORF2兩個(gè)主要的開放閱讀框(Open Reading Frame)，分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白R(shí)ep和結(jié)構(gòu)蛋白Cap。PCV有PCV1和PCV2兩種血清型，其中PCV2對(duì)豬體有致病性。PCV2可損害免疫器官，導(dǎo)致免疫抑制，易繼發(fā)其他病原的混合感染，引起豬圓環(huán)病毒?。≒orcine Circovirus Associate Disease，PCVAD

2、），如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）、豬皮炎腎病綜合征(PorcineDermatitis and NepHropathy Syndrome，PDNS)、豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineRespiratory and Reproductive Syndrome，PRRSV)、關(guān)節(jié)炎等，其中PMWS可造成豬體嚴(yán)重的免疫抑制，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來(lái)經(jīng)濟(jì)

3、損失。
　　豬圓環(huán)病毒2型ORF2編碼的Cap蛋白，是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包含多個(gè)B細(xì)胞表位與中和表位，具有良好的抗原性，可以誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。PCV2抗體檢測(cè)技術(shù)有ELISA、IPMA、IFA等，其中ELISA方法一次可檢測(cè)大量血清樣品，結(jié)果判定易于標(biāo)準(zhǔn)化，更適用于臨床血清的大量檢測(cè)。目前我國(guó)商品化的PCV2 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，都是間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)抗原純度要求較高，并可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。為了克服

4、這些缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室以5H7酶標(biāo)鼠單抗為基礎(chǔ)，建立了PCV2 Cap蛋白的阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法。本研究以此為基礎(chǔ)，組裝了檢測(cè)PCV2抗體的阻斷ELISA試劑盒，并應(yīng)用試劑盒對(duì)臨床血清進(jìn)行了檢測(cè)，評(píng)價(jià)試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)。
　　本研究的具體內(nèi)容如下:
　　1.PCV2阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒各組分的制備
　　根據(jù)已建立的PCV2 Cap蛋白阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法，本研究分別制備了試劑盒中所需的各個(gè)組分，包括Cap

5、蛋白、抗原包被板、標(biāo)準(zhǔn)陰性陽(yáng)性對(duì)照血清、HRP-5H7酶標(biāo)鼠單抗工作液、TMB顯色液、終止液、樣品稀釋液、10×濃縮洗滌液，并對(duì)其進(jìn)行的鑒定，結(jié)果表明:表達(dá)純化后的重組Cap蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在41kDa處有明顯的條帶且無(wú)明顯雜帶，符合重組蛋白大小，抗原性好;標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性對(duì)照血清經(jīng)Western-Blot分析，陽(yáng)性血清在41kDa處與Cap蛋白有反應(yīng)條帶而陰性血清無(wú);5H7酶標(biāo)鼠單抗工作液經(jīng)Western-Blot鑒定，與Ca

6、p蛋白在41kDa有反應(yīng)條帶;TMB顯色液能與辣根過(guò)氧化物酶(Horse Radish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的5H7單抗正常反應(yīng)，表明制備的試劑盒各組分符合各試劑的要求。
　　2.PCV2阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒各組分的質(zhì)量檢測(cè)
　　為了保證試劑盒各組分的質(zhì)量，本研究從性狀檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)、效價(jià)檢驗(yàn)等各方面對(duì)制備的試劑盒各組分進(jìn)行了檢驗(yàn)。結(jié)果表明:表達(dá)純化后的重組Cap蛋白，純度高，3個(gè)不同批次蛋白間重復(fù)性好

7、且濃度都在0.8mg/mL以上;包被Cap抗原的酶標(biāo)板光滑無(wú)裂痕，真空密封良好無(wú)漏氣;標(biāo)準(zhǔn)陰性陽(yáng)性對(duì)照血清無(wú)菌檢驗(yàn)合格，PCR和ELISA檢測(cè)符合標(biāo)準(zhǔn);HRP-5H7酶標(biāo)鼠單抗工作液無(wú)菌檢驗(yàn)合格，效價(jià)檢測(cè)均大于1∶3000;顯色液、終止液、樣品稀釋液、10倍濃縮洗滌液、終止液經(jīng)性狀檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明制備的試劑盒各組分質(zhì)量合格，符合試劑盒的要求。
　　3.PCV2阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的組裝與保存
　　本研究將

8、試劑盒中關(guān)鍵組分用相應(yīng)的保護(hù)劑處理，然后組裝成抗體檢測(cè)試劑盒，采用30份PCV2陽(yáng)性血清檢測(cè)，其PCV2抗體效價(jià)為1∶32～256，對(duì)豬瘟(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病(PRV)、豬流感病毒(SIV)、口蹄疫病毒(FMDV)、PCV1和大腸桿菌陽(yáng)性血清檢測(cè)，結(jié)果都呈陰性，說(shuō)明該試劑盒敏感性和特異性較好。試劑盒分別置于37℃和4℃保存，進(jìn)行了加速試驗(yàn)和4℃保存試驗(yàn)。結(jié)果表明:試劑盒各組分及組裝成的試劑盒，在

9、37℃加速7天能表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性;在4℃長(zhǎng)期保存12個(gè)月性狀及性能保持穩(wěn)定。說(shuō)明該組裝的試劑盒在保存期間性質(zhì)穩(wěn)定且良好，能用于臨床血清的大量檢測(cè)。
　　4.PCV2阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
　　為了研究本試劑盒在臨床中的應(yīng)用效果，本研究應(yīng)用組裝好的阻斷ELISA試劑盒，檢測(cè)不同疫苗免疫豬群、PMWS發(fā)病豬群與好轉(zhuǎn)健康豬群、不同豬場(chǎng)不同年齡段豬群的血清抗體水平，分析評(píng)價(jià)疫苗免疫效果及豬群中血清抗體分布情況，并比較與

10、商品化試劑盒檢測(cè)臨床血清的符合率。檢測(cè)結(jié)果表明:不同免疫組之間抗體變化規(guī)律基本類似，且抗體水平差異不明顯，其中油佐劑免疫組血清抗體水平相對(duì)較高;PMWS發(fā)病豬群血清抗體水平較同群好轉(zhuǎn)健康豬高;不同年齡段中育肥豬群血清抗體水平較高;與商品化試劑盒的符合率為90.91％。說(shuō)明該阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)，能很好的區(qū)分不同豬體血清抗體水平，有效的評(píng)價(jià)疫苗免疫效果，適用于臨床血清的大量快速檢測(cè)。
　　綜上所述，本研究成