豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白阻斷ELISA抗體檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）是最小的一種動物病毒，含有ORF1和ORF2兩個主要的開放閱讀框(Open Reading Frame)，分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白Rep和結(jié)構(gòu)蛋白Cap。PCV有PCV1和PCV2兩種血清型，其中PCV2對豬體有致病性。PCV2可損害免疫器官，導(dǎo)致免疫抑制，易繼發(fā)其他病原的混合感染，引起豬圓環(huán)病毒病（Porcine Circovirus Associate Disease，PCVAD

2、），如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）、豬皮炎腎病綜合征(PorcineDermatitis and NepHropathy Syndrome，PDNS)、豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineRespiratory and Reproductive Syndrome，PRRSV)、關(guān)節(jié)炎等，其中PMWS可造成豬體嚴(yán)重的免疫抑制，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來經(jīng)濟

3、損失。
　　豬圓環(huán)病毒2型ORF2編碼的Cap蛋白，是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包含多個B細(xì)胞表位與中和表位，具有良好的抗原性，可以誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答。PCV2抗體檢測技術(shù)有ELISA、IPMA、IFA等，其中ELISA方法一次可檢測大量血清樣品，結(jié)果判定易于標(biāo)準(zhǔn)化，更適用于臨床血清的大量檢測。目前我國商品化的PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒，都是間接ELISA檢測方法，對抗原純度要求較高，并可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。為了克服

4、這些缺點，本實驗室以5H7酶標(biāo)鼠單抗為基礎(chǔ)，建立了PCV2 Cap蛋白的阻斷ELISA抗體檢測方法。本研究以此為基礎(chǔ)，組裝了檢測PCV2抗體的阻斷ELISA試劑盒，并應(yīng)用試劑盒對臨床血清進行了檢測，評價試劑盒的各項指標(biāo)。
　　本研究的具體內(nèi)容如下:
　　1.PCV2阻斷ELISA抗體檢測試劑盒各組分的制備
　　根據(jù)已建立的PCV2 Cap蛋白阻斷ELISA抗體檢測方法，本研究分別制備了試劑盒中所需的各個組分，包括Cap

5、蛋白、抗原包被板、標(biāo)準(zhǔn)陰性陽性對照血清、HRP-5H7酶標(biāo)鼠單抗工作液、TMB顯色液、終止液、樣品稀釋液、10×濃縮洗滌液，并對其進行的鑒定，結(jié)果表明:表達(dá)純化后的重組Cap蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在41kDa處有明顯的條帶且無明顯雜帶，符合重組蛋白大小，抗原性好;標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對照血清經(jīng)Western-Blot分析，陽性血清在41kDa處與Cap蛋白有反應(yīng)條帶而陰性血清無;5H7酶標(biāo)鼠單抗工作液經(jīng)Western-Blot鑒定，與Ca

6、p蛋白在41kDa有反應(yīng)條帶;TMB顯色液能與辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的5H7單抗正常反應(yīng)，表明制備的試劑盒各組分符合各試劑的要求。
　　2.PCV2阻斷ELISA抗體檢測試劑盒各組分的質(zhì)量檢測
　　為了保證試劑盒各組分的質(zhì)量，本研究從性狀檢驗、無菌檢驗、效價檢驗等各方面對制備的試劑盒各組分進行了檢驗。結(jié)果表明:表達(dá)純化后的重組Cap蛋白，純度高，3個不同批次蛋白間重復(fù)性好

7、且濃度都在0.8mg/mL以上;包被Cap抗原的酶標(biāo)板光滑無裂痕，真空密封良好無漏氣;標(biāo)準(zhǔn)陰性陽性對照血清無菌檢驗合格，PCR和ELISA檢測符合標(biāo)準(zhǔn);HRP-5H7酶標(biāo)鼠單抗工作液無菌檢驗合格，效價檢測均大于1∶3000;顯色液、終止液、樣品稀釋液、10倍濃縮洗滌液、終止液經(jīng)性狀檢驗、無菌檢驗符合標(biāo)準(zhǔn)。說明制備的試劑盒各組分質(zhì)量合格，符合試劑盒的要求。
　　3.PCV2阻斷ELISA抗體檢測試劑盒的組裝與保存
　　本研究將

8、試劑盒中關(guān)鍵組分用相應(yīng)的保護劑處理，然后組裝成抗體檢測試劑盒，采用30份PCV2陽性血清檢測，其PCV2抗體效價為1∶32～256，對豬瘟(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病(PRV)、豬流感病毒(SIV)、口蹄疫病毒(FMDV)、PCV1和大腸桿菌陽性血清檢測，結(jié)果都呈陰性，說明該試劑盒敏感性和特異性較好。試劑盒分別置于37℃和4℃保存，進行了加速試驗和4℃保存試驗。結(jié)果表明:試劑盒各組分及組裝成的試劑盒，在

9、37℃加速7天能表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性;在4℃長期保存12個月性狀及性能保持穩(wěn)定。說明該組裝的試劑盒在保存期間性質(zhì)穩(wěn)定且良好，能用于臨床血清的大量檢測。
　　4.PCV2阻斷ELISA抗體檢測試劑盒的應(yīng)用
　　為了研究本試劑盒在臨床中的應(yīng)用效果，本研究應(yīng)用組裝好的阻斷ELISA試劑盒，檢測不同疫苗免疫豬群、PMWS發(fā)病豬群與好轉(zhuǎn)健康豬群、不同豬場不同年齡段豬群的血清抗體水平，分析評價疫苗免疫效果及豬群中血清抗體分布情況，并比較與

10、商品化試劑盒檢測臨床血清的符合率。檢測結(jié)果表明:不同免疫組之間抗體變化規(guī)律基本類似，且抗體水平差異不明顯，其中油佐劑免疫組血清抗體水平相對較高;PMWS發(fā)病豬群血清抗體水平較同群好轉(zhuǎn)健康豬高;不同年齡段中育肥豬群血清抗體水平較高;與商品化試劑盒的符合率為90.91％。說明該阻斷ELISA抗體檢測試劑盒敏感性高、特異性強，能很好的區(qū)分不同豬體血清抗體水平，有效的評價疫苗免疫效果，適用于臨床血清的大量快速檢測。
　　綜上所述，本研究成