豬圓環(huán)病毒II型抗體檢測(cè)ELISA試劑盒的研制.pdf

1、豬圓環(huán)病毒是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒。PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，并且與豬皮炎與腎炎綜合征、以及豬呼吸道綜合征、先天性震顫、腸炎、繁殖障礙等疾病的發(fā)生有關(guān)。自1991年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，豬圓環(huán)病毒已成為世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)豬業(yè)最大的病原體之一。因此PCV2的早期臨床診斷，對(duì)于PCV2的防控是至關(guān)重要的。本研究建立了一種簡(jiǎn)便、快速

2、、靈敏的試驗(yàn)方法和工具，研制出可用于臨床血清檢測(cè)的PCV2型抗體檢測(cè)試劑盒。
　　PCV2基因組包含有11個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中ORF1和ORF2是最主要的閱讀框。ORF1編碼Rep蛋白，主要與病毒復(fù)制有關(guān)，此類蛋白在這兩型病毒之間的同源性為85％，是引起PCV1和PCV2抗原交叉反應(yīng)的主要原因。ORF2編碼Cap蛋白，此類是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是型特異性抗原，具有良好的免疫原性，在兩型PCV之間不發(fā)生抗原交叉反應(yīng)，所以O(shè)RF2蛋白可

3、以作為抗原建立區(qū)別兩型PCV的血清學(xué)檢測(cè)方法。
　　ORF2所編碼蛋白的N端的信號(hào)肽序列與抗原性無(wú)關(guān)，會(huì)影響蛋白的可溶性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)將去除N端信號(hào)肽的ORF2片段在大腸桿菌中BL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá)。SDS-PAGE凝膠電泳表明在26 kD處有一個(gè)明顯的表達(dá)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組蛋白表達(dá)成功。
　　為提高ORF2蛋白表達(dá)的產(chǎn)量，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定終濃度為0.8 mM的IPTG誘導(dǎo)10

4、個(gè)小時(shí)可以使ORF2的產(chǎn)量達(dá)到最高。同時(shí)確定在30℃誘導(dǎo)的條件下，ORF2的可溶性蛋白產(chǎn)量最高。使用鎳柱親和層析對(duì)表達(dá)的可溶性蛋白進(jìn)行純化，使用豬圓環(huán)病毒陽(yáng)性血清對(duì)純化后的ORF2蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果表明，重組ORF2蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為包被原進(jìn)行豬圓環(huán)病毒抗體的檢測(cè)。
　　以表達(dá)的ORF2蛋白作為包被原，建立了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒抗體的間接ELISA方法：最佳抗原包被濃度為5μg/mL，最佳包被時(shí)間為

5、4℃過(guò)夜，最佳封閉液為5%脫脂奶，一抗最佳稀釋度為1:1000，作用時(shí)間為30 min，二抗最佳稀釋度為1:4000，作用時(shí)間為1 h，最佳顯色時(shí)間為5 min。當(dāng)血清P/N值大于0.356時(shí)，為陽(yáng)性；當(dāng)血清P/N值小于0.317時(shí)，為陰性。與商品化試劑盒同時(shí)檢驗(yàn)78份臨床血清，符合率為95%；同時(shí)與豬瘟病毒，豬細(xì)小病毒株、豬藍(lán)耳病毒，豬乙腦病毒，豬偽狂犬病毒的陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)。
　　本研究表達(dá)了去除信號(hào)肽序列的豬圓環(huán)病毒OR