豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒組裝及漢賽巴爾通體間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬嗜血支原體（Mycoplasma haemosuis，M.suis）是一種寄生于紅細(xì)胞表面的病原微生物，臨床上慢性感染表現(xiàn)為輕度貧血，消瘦，繁殖機(jī)能障礙等，急性病例死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，但目前血清學(xué)診斷技術(shù)研究較少，尚無(wú)商品化試劑盒。因此，研究豬嗜血支原體的血清診斷試劑盒非常重要。MSG1蛋白是M.suis的一種重要的表面黏附蛋白，具有良好的免疫原性。本研究在實(shí)驗(yàn)室已建立的豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的基礎(chǔ)

2、上，成功組裝試劑盒，并對(duì)其性能進(jìn)行測(cè)定。
　　漢賽巴爾通體（Bartonella henselae，B.henselae）是目前已知的致病種類最多的巴爾通體，是貓抓病(SCD)的病原體，17-kDa蛋白是漢賽巴爾通體中能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的較少蛋白之一，適合用來(lái)建立檢測(cè)方法。
　　本研究具體內(nèi)容如下:
　　1.豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢澍試劑盒各組分的制備與質(zhì)量檢測(cè)
　　本研究在實(shí)驗(yàn)室已建立的豬嗜血支原

3、體阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)試劑盒各個(gè)組份進(jìn)行制備，并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，純化后獲得的重組MSG1蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在45kDa處有明顯的表達(dá)帶，無(wú)明顯雜帶，且抗原性良好，三批蛋白的濃度均為0.5mg/mL以上，能用于試劑盒的制備;包被MSG1蛋白抗原包被板、陰陽(yáng)性對(duì)照血清、酶標(biāo)抗體、稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液經(jīng)性狀檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)及效價(jià)檢驗(yàn)顯示均具有良好的性質(zhì)，能用于試劑盒的組裝。
　　2.豬

4、嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的組裝與保存
　　本研究用保護(hù)劑分別處理ELISA方法中的關(guān)鍵試劑，然后組裝成試劑盒。進(jìn)行37℃加速試驗(yàn)及實(shí)時(shí)實(shí)溫試驗(yàn)，測(cè)定其保存期。結(jié)果為:試劑盒各組份在37℃進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)時(shí)，均能表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性;將各組份組裝成試劑盒后，37℃加速7d基本能保存穩(wěn)定，實(shí)時(shí)實(shí)溫試驗(yàn)證明在4℃保存6個(gè)月能基本保持穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，該試劑盒具有一定的穩(wěn)定性，為試劑盒最終開發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　3.豬

5、嗜血支原體血清流行病學(xué)調(diào)查
　　本研究采用阻斷ELISA方法對(duì)來(lái)自7個(gè)?。▍^(qū)）的1492份豬血清進(jìn)行了檢測(cè)并對(duì)其感染的時(shí)間、空間和種群間的分布進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:血清抗體總陽(yáng)性率為17.36％，其中上海地區(qū)最高為57.01％，廣西地區(qū)最低為4.55％，安徽、浙江、江蘇、江西和四川分別為28.40％、20.25％、13.93％、7.14％和5.49％。感染時(shí)間從6、7月份開始，9月份感染比例達(dá)到最高(33.94％)，然后開始慢慢下

6、降。種群間分析顯示母豬血清陽(yáng)性率為65.48％，仔豬為4.8％。血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示豬嗜血支原體在我國(guó)豬群的感染比較普遍，而且呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢(shì)。
　　4.漢賽巴爾通體17-kDa間接ELISA方法的建立
　　本研究將漢賽巴爾通體17-kDa蛋白基因按大腸桿菌密碼子偏嗜性改造后進(jìn)行全基因人工合成，然后將目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-17kDa，導(dǎo)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，

7、進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并用Ni-NTA純化試劑進(jìn)行純化;純化后的蛋白應(yīng)用His單抗進(jìn)行鑒定。以17-kDa蛋白作為包被抗原及優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立檢測(cè)抗?jié)h賽巴爾通體17-kDa蛋白抗體的間接ELISA方法:抗原包被量0.4μg/mL，37℃包被2h后4℃過(guò)夜，1％BSA37℃封閉3h，待檢血清稀釋度1∶100后37℃孵育1h，二抗1∶15000稀釋，37℃作用30min，抗體臨界值為OD450≥0.392判為陽(yáng)性，OD450≤0.3326判

8、為陰性，介于二者之間為可疑。與豬嗜血支原體、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬口蹄疫病毒等血清抗體無(wú)交叉反應(yīng)，批間和批內(nèi)重復(fù)性較好，對(duì)379份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，抗體陽(yáng)性檢出率達(dá)51.72％。說(shuō)明該方法可用于漢賽巴爾通體抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
　　綜上所述，本研究成功組裝了豬嗜血支原體阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，通過(guò)試驗(yàn)證明該試劑盒在2-8℃保存6個(gè)月能基本保持穩(wěn)定，為該試劑盒的最終產(chǎn)業(yè)化提供了實(shí)驗(yàn)