DHV-I抗體乳膠凝集試劑盒的研制和間接ELISA方法的建立.pdf

1、Ⅰ型鴨肝炎病毒(DHV-Ⅰ)引起的鴨病毒性肝炎(DVH)是一種高致病性傳播迅速的疾病，它已經(jīng)成為威脅養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。DHV-Ⅰ主要感染1月齡以下雛鴨，尤其是2周內(nèi)的更易感。免疫接種是預(yù)防和控制鴨肝炎的主要手段。DHV-Ⅰ疫苗通常是通過注射種鴨使其雛鴨獲得被動在免疫。為了適應(yīng)不同層次的檢測需要，本文研究并建立了檢測DHV-Ⅰ抗體的LAT和間接ELISA兩種方法，以用于監(jiān)控疫苗的免疫效果，指導(dǎo)制訂合理的免疫程序。具體研究成果如下：

2、r>　　 第一，本研究首先通過雞胚繁殖DHV-Ⅰ弱毒并進(jìn)行滅活，然后通過對比4種不同的純化方法，探索出一種簡單有效重復(fù)性好且利于大量制備純化病毒的方法--差速超高速離心法，用以制備檢測DHV-Ⅰ抗體的抗原。純化后的抗原采用磷鎢酸負(fù)染電鏡進(jìn)行觀察、鑒定，結(jié)果表明經(jīng)差速超高速離心后雜蛋白很少，病毒粒子清晰。
　　 第二，制備建立檢測方法所需的鴨源DHV-Ⅰ陽性與陰性血清，并經(jīng)中和試驗驗證所制DHV-Ⅰ陽性血清中和效價為1:32，陰

3、性血清不具有中和作用。
　　 第三，將經(jīng)過純化滅活后的病毒，作為包被抗原，建立了一種檢測鴨血清中抗體的間接ELISA方法。通過對反應(yīng)條件優(yōu)化，確定了各組分的最適工作條件為：抗原包被濃度為1:800(5.56μg/mL)，樣品稀釋濃度為1:256，二抗稀釋濃度為1:3200，陰陽性臨界值為0.249。通過對本方法的評估及對1058份樣品的檢測結(jié)果表明，本試驗建立的間接ELISA方法可用于鴨血清中DHV-Ⅰ抗體的實驗室檢測。

4、　　 第四，將經(jīng)過純化滅活的病毒用于致敏聚苯乙烯乳膠，建立了檢測DHV-Ⅰ抗體的LAT方法。經(jīng)過對該LAT進(jìn)行優(yōu)化，確定的最佳致敏條件為：致敏溫度37℃，病毒致敏量300μg/mL，致敏時間2.5h。通過對本方法的評估及對1058份樣品的檢測結(jié)果表明，本試驗建立的LAT方法可用于血清中DHV-Ⅰ抗體水平的臨床檢測，并通過試驗初步確定其臨床決定水平為“+++”。
　　 第五，為了進(jìn)一步評估該LAT和間接ELISA方法，將兩者進(jìn)行

5、了一系列的對比試驗。首先，應(yīng)用LAT、間接ELISA、與NT對來自20羽免疫了四次DHV-Ⅰ的鴨血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果一致符合且表明樣本為陽性。其次，使用間接ELISA和LAT分別對30個陰性血清樣本和1個陽性血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果兩者均能正確選擇出陽性樣本，并均具有較好的選擇性。再次，對相同40個血清樣本作倍比稀釋后進(jìn)行的檢測表明，雖然LAT與ELISA均表明40個樣本均為陽性，但是敏感性方面使用Stata軟件包進(jìn)行Kappa檢驗表明

6、：LAT與ELISA檢測結(jié)果的Kappa值為-0.012200，這表明兩者敏感性的一致性極差，差異顯著，且由均值可見ELISA更敏感。最后，通過對相同的1058個血清樣本進(jìn)行獨立檢測結(jié)果表明：與間接ELISA相比，LAT的敏感性為89.1％，特異性92.7%，總符合率為91.4%，Kappa值為0.815200，95%置信區(qū)間為[0.754965，0.875435]，可見兩試驗結(jié)果一致性極強。
　　 第六，本文研究的LAT試劑盒