鄰苯二甲酸酯類物質殘留ELISA方法的建立及試劑盒研制.pdf

1、鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是目前廣泛應用于工業(yè)生產的增塑劑，隨著增塑劑的廣泛使用，大量的PAEs暴露在環(huán)境中，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成巨大了的威脅。早在1995年，世界衛(wèi)生組織(WHO)就宣布必須加強對PAEs物質的監(jiān)控，繼臺灣增塑劑風波之后，對增塑劑特別是鄰苯二甲酸酯類物質的分析檢測的相關報道越來越多。報道過的檢測方法，如熒光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、液質聯(lián)用、氣質聯(lián)用等，雖然能夠在一定水平上實現(xiàn)對部分PAEs的檢測，但是

2、多數(shù)樣品前處理程序繁瑣，靈敏度較低，不適用于實時定量的監(jiān)控。因此建立一種快速簡便，高靈敏度的痕量檢測方法對實現(xiàn)PAEs實時監(jiān)控具有重要的意義，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)能夠很好的解決這一問題，它省去了前處理過程，成本低，特異性強，成為檢測PAEs的首選技術，而免疫分析的關鍵問題是制備出相應的抗體。
　　本研究主要分為兩個部分。
　　第一部分主要是初步建立了DMP殘留檢測的ELISA方法。以四硝基鄰苯二甲酸和甲醇為起始原料，合

3、成了具有DMP特征性結構的半抗原DMAP，采用重氮法將DMAP分別與卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)，合成了免疫原DMAP-OVA與包被原DMAP-BSA。用DMAP-OVA免疫BALB/c小鼠，經過四次免疫，斷尾采血收集血清用于ELISA分析，通過間接競爭ELISA建立了DMP檢測的標準曲線，標準曲線IC50達到311 ng/mL，證明血清中抗體特異性良好，能夠用于DMP的檢測，為后續(xù)細胞融合，雜交瘤細胞的篩選及單克隆抗體

4、的大量制備做好了準備。
　　第二部分實驗是DBP殘留檢測試劑盒的研制。首先復蘇本實驗室已制備出的DBP雜交瘤細胞株，經過三次有限稀釋法克隆化篩選之后，得到一株高靈敏度高效價的細胞株，采用小鼠體內誘生腹水法，進行抗體的大量制備，抗體用辛酸-硫酸銨法純化后，用于間接競爭ELISA條件的優(yōu)化，包括封閉液的選擇，競爭反應液中抗體穩(wěn)定劑含量，競爭反應時間，二抗反應溫度，顯色體系的選擇，生物素親和素放大系統(tǒng)與常規(guī)ELISA的比較，并在最優(yōu)條件