鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)殘留ELISA方法的建立及試劑盒研制.pdf

1、鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是目前廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的增塑劑，隨著增塑劑的廣泛使用，大量的PAEs暴露在環(huán)境中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成巨大了的威脅。早在1995年，世界衛(wèi)生組織(WHO)就宣布必須加強(qiáng)對(duì)PAEs物質(zhì)的監(jiān)控，繼臺(tái)灣增塑劑風(fēng)波之后，對(duì)增塑劑特別是鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的分析檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道越來(lái)越多。報(bào)道過(guò)的檢測(cè)方法，如熒光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等，雖然能夠在一定水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)部分PAEs的檢測(cè)，但是

2、多數(shù)樣品前處理程序繁瑣，靈敏度較低，不適用于實(shí)時(shí)定量的監(jiān)控。因此建立一種快速簡(jiǎn)便，高靈敏度的痕量檢測(cè)方法對(duì)實(shí)現(xiàn)PAEs實(shí)時(shí)監(jiān)控具有重要的意義，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)能夠很好的解決這一問(wèn)題，它省去了前處理過(guò)程，成本低，特異性強(qiáng)，成為檢測(cè)PAEs的首選技術(shù)，而免疫分析的關(guān)鍵問(wèn)題是制備出相應(yīng)的抗體。
　　本研究主要分為兩個(gè)部分。
　　第一部分主要是初步建立了DMP殘留檢測(cè)的ELISA方法。以四硝基鄰苯二甲酸和甲醇為起始原料，合

3、成了具有DMP特征性結(jié)構(gòu)的半抗原DMAP，采用重氮法將DMAP分別與卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)，合成了免疫原DMAP-OVA與包被原DMAP-BSA。用DMAP-OVA免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過(guò)四次免疫，斷尾采血收集血清用于ELISA分析，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA建立了DMP檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50達(dá)到311 ng/mL，證明血清中抗體特異性良好，能夠用于DMP的檢測(cè)，為后續(xù)細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞的篩選及單克隆抗體

4、的大量制備做好了準(zhǔn)備。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)是DBP殘留檢測(cè)試劑盒的研制。首先復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室已制備出的DBP雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)三次有限稀釋法克隆化篩選之后，得到一株高靈敏度高效價(jià)的細(xì)胞株，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法，進(jìn)行抗體的大量制備，抗體用辛酸-硫酸銨法純化后，用于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件的優(yōu)化，包括封閉液的選擇，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)液中抗體穩(wěn)定劑含量，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間，二抗反應(yīng)溫度，顯色體系的選擇，生物素親和素放大系統(tǒng)與常規(guī)ELISA的比較，并在最優(yōu)條件