雞傳染性貧血病毒重組抗原間接ELISA診斷試劑盒的研制.pdf

1、雞傳染性貧血(chicken infectious anemia,CIA)是由雞傳染性貧血病毒(chicken infectiousanemia virus,CIAV)引起雛雞的以壞疽、淋巴組織損傷和骨髓發(fā)育不全為特征的傳染病,是繼IBD后的一種重要的免疫抑制性疾病.目前,該病已成為世界性疾病,嚴重地威脅著養(yǎng)禽業(yè).但在現(xiàn)地,由于并發(fā)繼發(fā)的病毒性、細菌性傳染病或球蟲病升高了CIA的死亡率,而且以后者癥狀更為突出,導致臨床對該病的忽視,并且

2、因為傳統(tǒng)CIA血清學方法中的血清中和試驗(SN)和間接免疫熒光試驗(IFA)存在著費時、費力、對操作者技術(shù)要求高和僅適于實驗室診斷的問題,因此,急需一種快速、簡便、敏感、廉價和能檢測大批量樣品的診斷方法用于免疫雞群的抗體監(jiān)測和流行病學調(diào)查.CIAV的VP1蛋白不僅是病毒的唯一衣殼蛋白,也是主要的免疫原蛋白.該試驗用生物軟件分析vp1基因及其編碼產(chǎn)物,預測了該蛋白的抗原表位,并對預測的其富含抗原表位的C末端基因進行了原核表達.根據(jù)GenB

3、ank公布的標準毒株Cux-1基因序列,設(shè)計合成了一對引物,對CIAV-M9905株的vp1基因進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,可見一條1350bp的特異帶,用PstI酶切后,將其回收,克隆到pProEXHTa載體,再亞克隆到pGEX-6p-1載體中,得到重組質(zhì)粒pGEX-vp1,PCR鑒定為陽性者再用BamHI消化陽性質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠試劑盒回收大片段,自連后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,用BamHI鑒定為陽性者命名為pGEX-vp1(C)

4、,得到目的克隆.將重組陽性質(zhì)粒pGEX-vp1(C)轉(zhuǎn)入表達宿主菌BL<,21>中,經(jīng)終濃度為0.6mmol/L IPTG誘導,成功表達了VP1 C端基因,重組蛋白表達量占菌體蛋白的39.4﹪.經(jīng)ELISA檢測表明,表達的重組蛋白能被CIAV陽性血清識別,具有良好的抗原性.把表達的重組蛋白經(jīng)初步純化后用作包被抗原,建立了檢測CIAV血清抗體的間接ELISA方法,并確定了最適封閉液、最適抗原包被濃度、最適血清稀釋度、血清最適作用時間、酶標

5、抗體最適稀釋度和最適作用時間及底物最適顯色時間.包被的重組抗原不與雞新城疫(ND)、馬立克氏病(MD)、傳染性支氣管炎(IB)-Ⅰ型和Ⅱ型、禽流感(AI)-H9和H7型、雞法氏囊病(IBD)、雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)、禽白血病(AL)-J亞群、雞白痢陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng),表明建立的ELISA診斷方法具有良好的特異性.用該方法可檢出人工攻毒后110天81﹪的CIAV血清抗體,表明其具有很高的敏感性.批內(nèi)重復試驗,變異系數(shù)小于10﹪;批