馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗致弱過(guò)程病毒基因的進(jìn)化研究.pdf

1、20世紀(jì)70年代，哈爾濱獸醫(yī)研究所研制成功的馬傳染性貧血病毒（Equine Infectious Anemia Virus，EIAV）弱毒疫苗為控制馬傳染性貧血（Equine Infectious Anemia，EIA）在我國(guó)的流行做出了重要的貢獻(xiàn)。該研究成果榮獲1982年國(guó)家發(fā)明一等獎(jiǎng)。該疫苗克服了慢病毒疫苗的開(kāi)發(fā)難點(diǎn)，能在被免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)性免疫，是迄今為止唯一廣泛應(yīng)用并證明確實(shí)有效的慢病毒疫苗。馬傳染性貧血弱毒疫苗的成功

2、，其中必定蘊(yùn)藏著慢病毒致弱或誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的機(jī)制，在HIV疫苗開(kāi)發(fā)屢受挫折的背景下，系統(tǒng)闡明EIAV疫苗的減毒和保護(hù)機(jī)理，為HIV等慢病毒疫苗的研究提供參考。
　　EIAV弱毒疫苗是由自然野毒株經(jīng)馬體、驢體和體外培養(yǎng)的驢外周血白細(xì)胞及驢胎皮膚細(xì)胞長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)而成。本文通過(guò)PCR和RT-PCR的方法分別擴(kuò)增EIAV弱毒疫苗制備過(guò)程中不同代次病毒株的前病毒基因組序列、EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗（EIAVDLV121）及其親本毒株EIAV

3、LN40感染馬匹后5個(gè)月內(nèi)病毒S2/gp90序列，并進(jìn)行序列分析比較。研究結(jié)果表明：（1）EIAV在體外傳代致弱過(guò)程中 LTR、env和S2等區(qū)域是主要的變異區(qū)域；隨著病毒在體外傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加，各病毒株與親本毒株的遺傳距離逐漸增加；伴隨著病毒毒力的逐漸減弱，在基因組的各個(gè)區(qū)域出現(xiàn)了一系列穩(wěn)定變異位點(diǎn)，包括Gag的100A/T、103T/S和484D/N的替換；Pol的16K/E、598K/R和619N/D的替換；gp90的46A/E

4、、98G/R、103H/Y、189K/E、190E/K、193S/N、236D/-、237N/K、247E/K和321K/E的替換；Tat的7R/H的替換；S2的41T/I、51T/I和55Q/K的替換；Rev的74V/I的替換；LTR負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)的細(xì)胞因子AP-1結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子區(qū)E_box基序、R區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和TAR的起始位點(diǎn)的變異。（2）EIAVLN40在體內(nèi)進(jìn)化過(guò)程中病毒分為兩個(gè)大的分支，感染早期和無(wú)癥狀階段的病毒處在同一分支，

5、發(fā)病階段的病毒和EIAVLN40處在進(jìn)化樹(shù)的另一分支；gp90的變異主要分布在8個(gè)變異區(qū)，V3、V4和V5區(qū)的糖基化位點(diǎn)的變化通常與發(fā)病狀態(tài)有關(guān)，EIAVLN40和多數(shù)發(fā)病后的序列在這三個(gè)區(qū)域都具有糖基化位點(diǎn)191NSSN194、237NNTW240和280NDTS283；病毒進(jìn)化過(guò)程中，S2有12％以上的氨基酸出現(xiàn)穩(wěn)定的替換，這些變異的出現(xiàn)與疾病發(fā)展相關(guān)。（3）EIAVDLV121在體內(nèi)進(jìn)化過(guò)程中病毒gp90分成三個(gè)大的分支，各時(shí)間點(diǎn)

6、分離的病毒gp90與EIAVLN40的平均差異在0.91%-6.49%之間，與EIAVDLV121的差異在3.88%-6.73%之間；病毒S2基因進(jìn)化過(guò)程中分為兩個(gè)分支，各時(shí)間點(diǎn)分離的病毒 S2與 EIAVLN40的平均差異在0.79%-8.83%之間，與EIAVDLV121的差異在.3.08%-8.14%之間。
　　研究證實(shí)：在 EIAV弱毒疫苗制備過(guò)程中，隨著病毒毒力減弱在基因組的各個(gè)區(qū)域都出現(xiàn)了一系列穩(wěn)定的變異；EIAVLN