帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的中國馬傳染性貧血病毒疫苗株感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 馬傳染性貧血病毒(EIAV)與人免疫缺陷病毒(HW)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、綿羊梅迪-維斯納病毒(MVV)和山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬,是嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康的病原體[2,14]。它們在基因組結(jié)構(gòu)、病毒復(fù)制的分子機(jī)制、抗原漂移、細(xì)胞噬性、病毒的生活周期、免疫機(jī)理及病毒與宿主相互作用等方面都極為相似。其共同特點(diǎn)是侵害

2、宿主免疫系統(tǒng),在單核-巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞內(nèi)持續(xù)增歹直[36]。但EIAV作為慢病毒屬的一員,除具有一些慢病毒共同特性外,還有其獨(dú)具的特性[3～5]。EIAV潛伏期只有幾天至幾周而不像其他慢病毒屬高達(dá)幾年,而且,可產(chǎn)生高滴度的病毒血癥、劇烈的臨床病理學(xué)表現(xiàn)[30,31],在EIAV感染過程中,新的抗原變異株的出現(xiàn)與疾病復(fù)發(fā)相關(guān),因此其是研究慢病毒與宿主相互作用過程中抗原變異的極好模型[32]；與其它慢病毒感染明顯不同的是,慢性EIAV感染

3、經(jīng)歷一年左右的時(shí)間變?yōu)殡[性感染,病毒的表達(dá)長期被抑制,大部分馬在感染EIAV后有正常的壽命,部分感染馬最終能控制住病毒的復(fù)制。因此,鑒定這種免疫保護(hù)機(jī)制,對于慢病毒疫苗的研制具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 我國科學(xué)家在20世紀(jì)70年代利用經(jīng)典的異體傳代和細(xì)胞工程方法,將一株來源于馬體的EIAV超強(qiáng)毒力毒株LN經(jīng)過驢體連續(xù)傳代115余代使病毒毒力增強(qiáng)后獲得了驢強(qiáng)毒株DV(對馬和驢均100％致死),然后將DV株連續(xù)通過驢白細(xì)胞進(jìn)行體外培

4、養(yǎng)馴化,使得病毒毒力完全喪失,而保持了良好的免疫原性,最終成功培育出EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗DLA[6](沈榮顯等,1979),該疫苗免疫接種動(dòng)物不僅能產(chǎn)生強(qiáng)大持久的免疫力,而且能抵抗同源和異源強(qiáng)毒株的攻擊。即使強(qiáng)毒株攻擊免疫動(dòng)物,其也不受感染。經(jīng)過嚴(yán)格的安全檢驗(yàn),此疫苗在中國廣泛推廣使用,使得馬傳染性貧血病在中國得以有效控制。到目前為止,該疫苗是世界上唯一成功應(yīng)用的慢病毒弱毒疫苗。接種該疫苗后的馬能耐受致死劑量的EIAV的攻擊。這也使

5、得我國EIAV弱毒疫苗免疫保護(hù)及致弱的機(jī)理研究成為當(dāng)今慢病毒免疫基礎(chǔ)理論研究的熱點(diǎn)之一。其傳代培養(yǎng)致弱的分子機(jī)制及弱毒、強(qiáng)毒與接種動(dòng)物相互作用的致病、免疫機(jī)制都將豐富慢病毒的基本理論,并將為包括HIV在內(nèi)的其它慢病毒疫苗的研制提供重要的理論依據(jù)。自上世紀(jì)八十年代在發(fā)現(xiàn)HIV-1以后,全球更是對EIAV的分子生物學(xué)展開了廣泛研究并取得了很多成果[4,5,6],尤其是反向遺傳技術(shù)的發(fā)展為慢病毒的研究提供了新的思路。利用該技術(shù)在1998年成功

6、構(gòu)建的幾株不同毒力的EIAV感染性分子克隆,為揭示病毒毒力及其與宿主相互作用的機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 馬慢病毒受體1(ELRl)是近年來發(fā)現(xiàn)的(2005)[3,15],其屬于腫瘤壞死因子受體超家族蛋白,目前認(rèn)為它是EIAV的唯一受體。EIAV的env基因編碼gp90和gp45糖蛋白。表面糖蛋白存在于病毒囊膜中,大小約為90kDa,是高度糖基化的蛋白,構(gòu)成病毒纖突的柄,與宿主細(xì)胞膜上的受體相互作用。EIAV進(jìn)入靶細(xì)胞的方式是:病

7、毒囊膜中的gp90與受體ELRl結(jié)合,在低pH環(huán)境下(pH4.8-5.3)經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[4]。其能夠單獨(dú)支持EIAV血清強(qiáng)毒和細(xì)胞適應(yīng)毒進(jìn)入非EIAV靶細(xì)胞進(jìn)行增殖,但研究表明其發(fā)揮效應(yīng)時(shí)可能需要其它輔助受體的共同作用,同時(shí)是否像HIV一樣有輔助受體的存在尚無定論。
　　 在感染性克隆上加入熒光基團(tuán)標(biāo)記物標(biāo)記將有助于潛在受體的確定[16]。本文對已有的疫苗株感染性克隆進(jìn)行GFP分子標(biāo)記,并將構(gòu)建的感染性克隆進(jìn)行拯救包

8、裝出活的病毒顆粒,藉此研究馬傳染性貧血病毒與宿主細(xì)胞之間潛在的受體相互作用的致病機(jī)制以及疫苗保護(hù)效應(yīng)的因?yàn)?。此?論文內(nèi)容還將實(shí)驗(yàn)中片段連接的SOE-PCR技術(shù)[1,2,5,7,8,]做了部分的拓展和延伸,通過我們的實(shí)驗(yàn)改進(jìn),可以實(shí)現(xiàn)在單管反應(yīng)中的多片段連接。希望本文中的部分內(nèi)容可以為相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)人員提供參考。
　　 二、研究方法
　　 利用SOE-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)重疊的互補(bǔ)堿基的引物實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增過程中的兩片段延伸反應(yīng),快速

9、的實(shí)現(xiàn)基因的人工合成。該技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,主要包括感染性克隆的構(gòu)建、病毒基因組測序、病毒的遺傳變異分析、限制性片段多態(tài)性分析以及基因分型等方面。我們在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)也是基于此技術(shù)進(jìn)行的。利用SOE-PCR技術(shù)在已有的EIAV感染性分子克隆中加入帶有熒光標(biāo)記物EGFP進(jìn)行標(biāo)記。為研究增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因在活細(xì)胞中作為報(bào)告基因和篩選標(biāo)記的可行性,利用

10、分子克隆技術(shù),將質(zhì)粒pIRES2 EGFP片段定點(diǎn)插入到EIAV感染性克隆[6,24]氐拷貝表達(dá)載體上,構(gòu)建為重組質(zhì)粒PLGgfp-3-8。
　　 GFP是一種27k Da的單體[20],由238個(gè)氨基酸構(gòu)成,本身就是一個(gè)生物發(fā)光系統(tǒng),附帶有激發(fā)后能發(fā)射生物熒光的發(fā)光色基,其發(fā)光過程不同于其它生物發(fā)光組織,是不需熒光素酶參與的。GFP色基是由絲氨酸酪氨酸甘氨酸(SerTyGly)形成的環(huán)化三肽所構(gòu)成,并且只有色基包被在完整的GF

11、P蛋白中才能發(fā)出熒光(Cody et al,1993),被切斷的GFP(即使是C末端的少數(shù)幾個(gè)氨基酸)亦能導(dǎo)致GFP失去發(fā)光能力。光激發(fā)GFP熒光是一個(gè)特異性的獨(dú)立過程,并不需要任何的協(xié)同因子、底物或其它來自于水母的基因表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)能量由Ca2+.激活光蛋白(Aequorin)傳給GFP時(shí)引發(fā)熒光(Ward et al,1980)。當(dāng)GFP在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)并受到藍(lán)光或紫外光輻照時(shí)就可發(fā)出亮綠色熒光。
　　 EGFP[16]

12、是GFP突變系。EGFP發(fā)生了雙氨基酸取代,Leu(亮氨酸)取代Phe64(苯丙氨酸),Thr(蘇氨酸)取代Set65(絲氨酸)。EGFP在488nm處激發(fā)后燈熒光強(qiáng)度為wtGFP的35倍[20]。
　　 一般真核mRNA的翻譯都需要5'帽子來介導(dǎo)核糖體結(jié)合,微小RNA病毒家族則例外。這類病毒在其mRNA前沒有帽子位點(diǎn),但卻有600～1200bp的5'非翻譯區(qū),其中含有多個(gè)非起始AUG,這段長的非翻譯區(qū)叫做內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列

13、(Internal ribosome entry site,IRES)。IRES能招募核糖體對mRNA進(jìn)行翻譯。將IRES與外源cDNA融合,發(fā)現(xiàn)IRES能獨(dú)立地起始翻譯。
　　 在構(gòu)建好帶有熒光標(biāo)記的感染性克隆株后,我們進(jìn)一步的采用293FT細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染包裝拯救使病毒恢復(fù)為具有感染力的病毒顆粒。293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞系,293T以及293FT細(xì)胞由293細(xì)胞派生,同時(shí)表達(dá)SV40大T抗原,含有SV40復(fù)

14、制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)?？梢詮?fù)制。用穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作可以方便的進(jìn)行轉(zhuǎn)染。蛋白表達(dá)水平高,轉(zhuǎn)染后可以通過分析熒光表達(dá)強(qiáng)度可較容易地檢測到表達(dá)的蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞是過表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式。慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達(dá)重組后的感染性克隆載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,

15、在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細(xì)胞的感染,目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,整合到基因組,從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。為后續(xù)打下基礎(chǔ),藉此研究病毒抗原和受體之間相互作用的致病機(jī)制。
　　 三、結(jié)果與結(jié)論
　　 本研究對SOE-PCR技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),在加入一定稀釋度的中間引物后,能夠?qū)崿F(xiàn)3個(gè)片段的直接連接。利用該技術(shù)對已有的馬傳染性貧血病毒疫苗株感染

16、性克隆進(jìn)行EGFP分子標(biāo)記,測序結(jié)果表明長度為4.2Kb的大片段其突變的堿基數(shù)為一個(gè)堿基。在后續(xù)的對該技術(shù)的進(jìn)一步研究表明,利用該技術(shù)可完成5片段的總長度為8Kb的大片段連接,擴(kuò)大了多片段連接范圍,在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚無進(jìn)行如此大片段多片段連接成功的報(bào)道。
　　 將構(gòu)建的帶EGFP分子標(biāo)記的馬傳染性貧血病毒疫苗株感染性克隆進(jìn)行拯救,以包裝出能表達(dá)EGFP的具有感染性的病毒顆粒,藉此研究馬傳染性貧血病毒與宿主細(xì)胞之間潛在的受體相互作用