增強型綠色熒光蛋白嵌合腸道病毒71型感染性克隆的構建及初步應用.pdf

1、近年來，包括我國在內的東亞地區(qū)多次爆發(fā)由腸道病毒感染導致的手足口病(hand-foot and mout disease，HFMD)疫情。腸道病毒71型(EV71)是HFMD主要病原體之一，其重癥患者比例以及病死率均明顯高于其他腸道病毒，具有非常重要的公共衛(wèi)生意義。然而，目前尚無有效的針對性治療方法和預防疫苗，同時對于EV71的感染、致病機制等仍有許多基礎問題有待闡明。因此，需要進一步建立和完善針對EV71的研究技術和方法，這對支持EV

2、71的防控研究是十分必要的。本研究目的是以EV71感染性克隆為基礎建立一種新型的帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記的重組EV71病毒，并鑒定該重組病毒的特性及應用潛力，同時嘗試建立一種基于EGFP標記病毒的EV71中和抗體快速檢測方法。本研究結果可為EV71的防治研究提供重要的基礎和工具。
　　 EV71病毒基因組大小約為7.5kb，僅有一個開發(fā)閱讀框。本研究應用重組PCR技術在病毒ORF區(qū)與5'UTR區(qū)之間插入一個EGFP

3、基因及一個編碼-AITTL多肽的寡核苷酸序列。-AITTL-是能被病毒自身的特異性2A蛋白酶識別的多肽，經過2A蛋白酶的剪切，能將EGFP與病毒蛋白解離。因此，增強型綠色熒光蛋白嵌合的EV71病毒既能像普通EV71一樣感染細胞并復制，具有相同的抗原性，同時又能夠表達具有示蹤作用的EGFP。通過T7轉錄系統(tǒng)，該嵌合感染性克隆拯救得到的病毒(EV71-EGFP)，能夠進行穩(wěn)定的傳代。通過檢測病毒感染后表達的EGFP，可用于快速檢測和追蹤EV

4、71對細胞的感染情況。本研究應用EV71-EGFP感染多種不同組織來源的細胞系，通過分析感染細胞中的EGFP表達情況評價了不同細胞對EV71病毒的易感性。EGFP嵌合EV71重組病毒可為EV71的受體研究和抗病毒藥物研究提供參考和便利。
　　 同時，本研究應用EV71-EGFP初步建立了一種新型的快速、高通量的EV71中和抗體檢測方法。該方法是應用本研究構建的帶有綠色熒光蛋白基因標記的EV71病毒感染RD細胞，18小時后利用Be

5、ckman公司的paradigm analysis系統(tǒng)測定樣品孔中的EGFP熒光強度，進而計算出待測樣品的中和抗體滴度。此方法可利用自動化的儀器設備進行快速檢測，客觀性好，避免了傳統(tǒng)方法的主觀誤差，有利于進行快速高通量檢測。本研究進一步對該方法進行優(yōu)化和性能評價，結果顯示該方法與傳統(tǒng)的CPE中和方法以及的Elispot中和方法具有良好的相關性，三種方法的檢測結果平行比較體現(xiàn)出較好的一致性。同時，本研究應用該方法檢測了部分EV71單抗和多