腸道病毒71型(EV71)動(dòng)物感染模型的建立及在抗體治療評(píng)價(jià)中的應(yīng)用.pdf

1、人腸道病毒71型(EV71)是引起手足口病、腦炎、無(wú)菌性腦膜炎、神經(jīng)性肺水腫等疾病和癥狀的主要病原體。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì),近年來(lái)我國(guó)手足口病發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì),其中EV71是導(dǎo)致患病兒童重癥和死亡的禍?zhǔn)字?危害十分嚴(yán)重。然而,目前尚無(wú)有效的預(yù)防性疫苗和特效治療藥物上市,不利于疫情防控。研發(fā)EV71預(yù)防性疫苗及治療方法成為當(dāng)務(wù)之急,而有效的動(dòng)物感染模型是順利開(kāi)展上述研究的必要保障,同時(shí)也是探索病毒感染和致病機(jī)制的重要支持。目前對(duì)于E

2、V71動(dòng)物模型特別是小動(dòng)物模型的研究基礎(chǔ)較為薄弱,限制了相關(guān)研究的開(kāi)展。因此,本研究旨在建立一種能夠有效感染的EV71小動(dòng)物模型,并對(duì)可能影響該模型的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究及優(yōu)化,同時(shí)探索了將該模型應(yīng)用于EV71中和抗體體內(nèi)治療效果評(píng)價(jià)的可行性,為開(kāi)展EV71預(yù)防疫苗和新型治療性藥物研制提供了重要的基礎(chǔ)。
　　 本研究首先建立了用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的腸道病毒二級(jí)保存庫(kù),其中EV71病毒43份,其基因型覆蓋了A、C2、C4、C5、B3、B4

3、和B5;CA16病毒20份;CB3病毒7份。同時(shí)使用37株EV71各亞型毒株對(duì)一日齡小鼠毒力情況進(jìn)行考察,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大多數(shù)EV71病毒對(duì)小鼠毒力較弱,攻毒小鼠僅表現(xiàn)出顫抖、瘦弱等輕微癥狀或不感染;個(gè)別毒株會(huì)引發(fā)明顯CNS感染癥狀,經(jīng)IHC檢測(cè)在神經(jīng)組織等檢測(cè)到病毒增殖,但是發(fā)病率較低,無(wú)法滿足動(dòng)物模型的構(gòu)建需要。
　　 隨后,進(jìn)一步通過(guò)對(duì)小鼠攻毒方式、攻毒劑量和實(shí)驗(yàn)小鼠品系的探索中發(fā)現(xiàn),這些條件的優(yōu)化無(wú)法使EV71對(duì)小鼠感染

4、能力顯著提高,缺乏強(qiáng)毒株成為模型構(gòu)建的首要問(wèn)題。隨后我們采用兩種策略同時(shí)進(jìn)行EV71強(qiáng)毒株的研制,一是通過(guò)病毒在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代的方法,經(jīng)過(guò)4輪后獲得了2株小鼠適應(yīng)株pSVA-MP4和5535.MP4,經(jīng)攻毒驗(yàn)證這兩種小鼠適應(yīng)株對(duì)小鼠具有高度的神經(jīng)侵染毒力,與EV71在人體內(nèi)的感染情況極為相似。二是利用中心已建立的反向遺傳學(xué)技術(shù)平臺(tái),突變EV71感染性克隆的小鼠毒力位點(diǎn),獲得了一株具有較高神經(jīng)侵染毒力的基因定點(diǎn)突變株,經(jīng)IHC檢測(cè)在神經(jīng)

5、組織等檢測(cè)到病毒增殖。
　　 在實(shí)驗(yàn)中收集了病毒感染動(dòng)物的多種標(biāo)本,摸索了不同組織標(biāo)本處理的方法,初步建立了動(dòng)物標(biāo)本病理檢測(cè)和分析技術(shù)平臺(tái),并通過(guò)將病毒分離、RT-PCR和病理分析等方法結(jié)合起來(lái)檢測(cè)EV71感染。至此,已初步建立了EV71小鼠感染模型,即通過(guò)腹腔注射小鼠適應(yīng)株pSVA-MP4,感染一日齡BALB/c小鼠的EV71動(dòng)物模型。
　　 本研究通過(guò)使用已建立的EV7l動(dòng)物感染模型評(píng)價(jià)了3株VP2特異性單抗和1份V